熒光顯微鏡之熒光激發(fā)塊的選擇

在生命科學(xué)領(lǐng)域，隨著科研水平和實驗手段不斷的提高，熒光染色方法以其特異性強(qiáng)，使用相對于放射性元素更安全，檢測越來越靈敏等特點，受到越來越多的研究人員的認(rèn)可，并且在實驗室中廣泛應(yīng)用，成為經(jīng)常性的實驗方法。
檢測熒光方法和手段根據(jù)不同的實驗要求和目的也多種多樣，使用Zui多的還是熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀等。但是，無論何種儀器，無論儀器的性能如何，要得到準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)，Zui基本的條件就是根據(jù)所使用的熒光染料正確設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長。
下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例，介紹一下濾色鏡組的構(gòu)造以及根據(jù)染料，如何正確選擇濾色片。
熒光激發(fā)塊是熒光顯微鏡中用來激發(fā)熒光標(biāo)本和觀察熒光的核心部件，它實際是濾色片的組合，一般含有3種濾色片:
1. 激發(fā)濾色片（Exciter Filter）：選擇透過某個波段的光，來激發(fā)熒光染料。
2. 分色鏡 （Dichroic Mirror）：反射激發(fā)光，透過熒光，一般激發(fā)光波長短，而發(fā)射光波長較長。
3. 發(fā)射濾色片(Barrier Filter) ：透過發(fā)射光，也就是我們看到的“熒光”。同時阻擋各種雜散光和激發(fā)光的反射光。

根據(jù)熒光觀察的原理—熒光染料吸收特定波長的光（即激發(fā)光），躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再釋放出特定波長的發(fā)射光（即熒光），回到基態(tài)。由此可知熒光染料所需的激發(fā)光和釋放的熒光都是特定波長的，所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現(xiàn)熒光觀察。否則，就會出現(xiàn)激發(fā)不了，激發(fā)了卻看不到或串色的現(xiàn)象。所以選擇合適的濾色片非常重要！
下面我們以熒光染料DAPI為例，闡述該如何選擇熒光激發(fā)塊。

通過上圖，我們可以了解到DAPI的激發(fā)光波長為300nm-410nm左右，激發(fā)峰值在360nm左右，也就是說激發(fā)光在300-410nm時可以激發(fā)DAPI染料，在360nm時激發(fā)效率Zui高。發(fā)射光波長為390nm-600nm，峰值在470nm左右。接著，我們就根據(jù)這些數(shù)據(jù)來選擇濾色片。

上圖為Olympus U-FUW激發(fā)塊的光譜信息。我們可以了解到此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光波長在300-400nm之間，剛好可以激發(fā)DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上，所以此激發(fā)塊可以用來實現(xiàn)DAPI熒光染料的觀察。
讓我們再來看一個激發(fā)塊的光譜圖：

上圖為olympus U-FGW激發(fā)塊的光譜信息，可以看出此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光在530-560nm左右，允許透過的熒光光譜范圍在570nm以上，所以此激發(fā)塊并不適合DAPI激發(fā)。如果用此激發(fā)塊來做DAPI的觀察，就會出現(xiàn)看不到熒光的現(xiàn)象。
可見，要選擇合適的熒光激發(fā)塊，我們首先要知道熒光染料激發(fā)和發(fā)射光的波長特性和激發(fā)塊光譜的各項數(shù)據(jù)。但是，熒光染料和濾色片的種類非常多，用戶往往沒有渠道來獲取這些信息。在實際實驗中使用熒光顯微鏡時，因為熒光激發(fā)塊配置錯誤而得不到好的觀察效果的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，對于用戶來說是一件非常煩惱的事。
為了方便用戶正確選擇激發(fā)和發(fā)射波長，節(jié)省時間，日本理化研究所腦科學(xué)所－奧林巴斯合作中心開發(fā)了軟件Spectrum Manager。用戶選擇熒光染料，軟件會給出染料的光譜信息和推薦的濾色片選擇等信息，使用非常方便。

還可利用Data Manager自行對光源信息、染料數(shù)據(jù)庫或濾色片信息進(jìn)行更新。

此款軟件已經(jīng)整合至奧林巴斯共聚焦顯微鏡的一款軟件中，發(fā)布以來得到了用戶非常好的反響。由于是針對共聚焦顯微鏡的軟件，所以軟件中僅提供了激光光源譜線。如果您有需要，也可以將汞燈和氙燈光源信息導(dǎo)入至軟件。
以下提供普通熒光顯微鏡常用的汞燈和氙燈光源的圖譜，供大家參考。

汞燈在313, 334, 365, 406, 435, 546, 578nm有比較好的激發(fā)峰。

氙燈在可見光光譜范圍內(nèi)強(qiáng)度更穩(wěn)定（沒有像汞燈那樣的光譜峰值），在紅外波段比汞燈強(qiáng)度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。
所以選擇光源時，光源特性一定要與我們的具體應(yīng)用相匹配。