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　　(三)6孔板接種和換液：

　　問：我的細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對比），總有兩三個孔（隨機(jī)）細(xì)胞長得不好，很小，像破碎了。有人碰到過這種情形嗎？到底是啥原因呢？請各位指導(dǎo)

　　答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細(xì)胞剛剛拿出來換液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細(xì)胞就會凍死了。建議你Zui好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。

　　另外，跟你細(xì)胞的生長狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀況良好。

　　或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問題，你再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀況問題了，種板時的血清濃度調(diào)高試一下

　　問：Zui近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后改換培養(yǎng)基，在調(diào)換培養(yǎng)基之前，顯微鏡視察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，調(diào)換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)明每個孔中都近乎有一半的細(xì)胞表示出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，發(fā)生大批的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個圓是好的，下半個圓就不好，這是怎么一回事？

　　答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放程度。有一回我也涌現(xiàn)過這種情況。

　　你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過期，細(xì)胞就不會貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。

　　我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問題，換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。

　　不知樓主所需換液的培育板多未幾，換造就基的時候如果沒有注意風(fēng)機(jī)的影響，特殊是所需換液的培養(yǎng)板很多時，輕易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮決裂。假如如此，換液時應(yīng)當(dāng)逐個培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕?lián)]霍吸管，注意操作的效力！

　　(四)24孔板接種：

　　問：我把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，總是每孔的中間部分長不滿，天天換液時都用PBS 清洗，第二天換液時都呈現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊沿長的很好，中央大批死細(xì)胞，我也不知道是什么原因，請各位高手仁兄給把把脈，先謝過?。。。。。。?！

　　答：是中央長不滿，還是中央有和邊沿雷同密度的細(xì)胞，但是大部分都是逝世細(xì)胞？如果是前者，也許不是技巧問題，而是物理問題了。

　　我是選擇孔內(nèi)展蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細(xì)胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？

　　我想你的造就液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊沿液領(lǐng)會向上走，造成培養(yǎng)液面浮現(xiàn)一個凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中心的細(xì)胞正好在凹面的Zui低處，培育液少，細(xì)胞的養(yǎng)分不夠，甚至干枯掉，空氣中的氧氣也會造成損傷，即使有增值過來的細(xì)胞也會逝世掉。

　　估量你的培養(yǎng)液里可能有珍貴的"銀子"（因子）啊，想少用點(diǎn)吧，成果就…… ：）

　　另外，檢討一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，假如少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時光，由于蒸發(fā)，液體量會減少，造成中心干枯。并且這樣會轉(zhuǎn)變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過高。

　　個人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問題:24孔板小，細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后浮現(xiàn)四周到中間稀的狀態(tài).

　　至于中間較多逝世細(xì)胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比擬粗魯?shù)呐鲎?，似乎對搖均勻細(xì)胞有必定后果.

　　在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果完整汲取，很容易造成細(xì)胞干枯，這樣的話細(xì)胞會很快死亡。我有一段時間總是碰到這個問題，一個板子中總有一兩個孔呈現(xiàn)細(xì)胞大批死亡，后來發(fā)明是上面的原因?，F(xiàn)在我做的時候如果必需把液體吸干，我會一個一個空來汲取，Zui多一次不超過3孔，然后馬上加入液體，同時在作轉(zhuǎn)染時，我會在吸液和加液時將風(fēng)機(jī)關(guān)掉，這樣基礎(chǔ)上會避免細(xì)胞死亡。

　　同時你所說的細(xì)胞四周密而中間稀少，大約有如下原因：

　　1.培養(yǎng)液加得太少。重要是由于液體張力的問題。

　　2.細(xì)胞接種后震動太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍。

　　我的細(xì)胞在接種在24孔板上時，孔的 四周細(xì)胞密集，中間細(xì)胞稀疏，我試了很多次均如此。請問怎樣操作才干使細(xì)胞散布均勻？

　　周圍細(xì)胞密集，中間細(xì)胞稀疏

　　這種情形一般是種板時培養(yǎng)液過少，液面總是呈一凹面，如果液面過低，孔中間就基礎(chǔ)上沒什么細(xì)胞，所以種板時必定不能小氣培養(yǎng)液，待貼壁后可以用比擬少量的培養(yǎng)液處置

　　四周細(xì)胞稀疏，中間細(xì)胞密集:這種情況一般是種板后過于晃動，特殊是旋轉(zhuǎn)著晃動.有人才用十字方向的晃動方式使細(xì)胞疏散均勻.但我個人認(rèn)為，將細(xì)胞加進(jìn)孔后，用槍或移液器充足吹打混勻后就不用，也不能再晃動，甚至拿著孔板走路帶來的震撼都會讓細(xì)胞往中間集中.

　　當(dāng)然，無論是哪種情況，首先都需要保證細(xì)胞在種板時時均勻分布的，即種板時的細(xì)胞懸液一定要混勻

　　細(xì)胞散布均勻與否有一點(diǎn)很要害，即每種細(xì)胞是有個體差別的，別人的細(xì)胞操作不一定合適于你.所以要靠自己探索，且找出專屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律，就我個人而言，有如下經(jīng)驗(yàn)：

　　1.所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。

　　2.按材料記錄，24孔板的液體量為1ml，個人也感到1ml的量足矣。

　　3.接種時，要慢慢加樣，且記得稍微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對細(xì)胞均勻分布有一定效果。

　　4.接種后Zui好直接放進(jìn)培養(yǎng)箱讓細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)板這個新的環(huán)境，個人以為沒有必要在室溫放置一段時光。

　　5.依據(jù)細(xì)胞的特征，細(xì)胞均愛好湊集在邊緣生長，所以我斟酌到，你的問題還有可能是接種時的細(xì)胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀少的錯覺。你的拌種密度是多少？

　　另"要慢慢加樣，且記得稍微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個加樣處湊集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊運(yùn)動槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布，我個人認(rèn)為有一定的效果，不知這次我說明明白沒有。

　　五)96孔板細(xì)胞接種換液和收集細(xì)胞

　　問：Zui近我用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，成果細(xì)胞長得不是很幻想，不是長得不均勻，就是每個孔細(xì)胞生長速度不一樣。另外，鏡下視察細(xì)胞輪廓很不清楚，怎么調(diào)焦距效果都不好。（板子是剛拆封的。）不知道怎么回事？

　　答：You should make sure that you triturate the cells very well. If the cells tend to form clumps， use a pasteur pipet and pass the cells several times. Then count the cell using Trypan Blue. Plate 1-5*10^4 per well， depending on your desired density. Usually， only the 60 wells in the middle should be used for plating cells. Wells on the edge will have a decreased volume of media， so you should not add any cells in there， but you still need to put media or H2O inside those 36 wells.

　　首先你要盡可能把消化細(xì)胞消化成單個細(xì)胞（不要成團(tuán)），重復(fù)吹打，控制好時光（不同的細(xì)胞要探索的），種細(xì)胞時要均勻的吸取，清清的吹打一遍再汲取細(xì)胞，這樣也許會解決您的問題。我以前也是呈現(xiàn)這樣問題。后來就很好了！！

　　種到96孔板的細(xì)胞必定要消化成單個細(xì)胞，建議用EDTA和胰酶消化。加血清后重復(fù)奏樂。細(xì)胞量盡量少一點(diǎn)。

　　我一般在展板時都是用八排槍加樣的，感到后果還不錯。首先如樓上所說要把細(xì)胞消化的恰到利益，背著光看瓶內(nèi)情胞都下來后再對著瓶壁奏樂幾次即可。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到加樣槽中，在加樣進(jìn)程中，要不停的輕輕晃動加樣槽，且在每次吸樣前都吹打幾次，以防細(xì)胞不是均勻的疏散在培養(yǎng)基中，造成加樣不均。加樣時使槍頭貼著孔壁遲緩參加，使液體自然流滿即可。都加完后安穩(wěn)拿到鏡下察看鋪的很美麗的。聽別人說鋪完后在96孔板的四個角輕輕磕幾下，但我試過，這樣效果反倒不好！

　　我感到你的問題可能是消化的不好，我的經(jīng)驗(yàn)盼望能有輔助：

　　1、對細(xì)胞的選擇要注意，要選擇狀態(tài)好的細(xì)胞，密度要選分布瓶底80％為宜；

　　2、消化時，不要忘了用PBS（或純的不含血清的培養(yǎng)基）洗一遍，加0.25％的胰酶1ml消化2-3分鐘（不同的細(xì)胞有差異，你要探索），還要不時的運(yùn)動，讓胰酶散布到每個角落，之后傾去胰酶，加3ml培養(yǎng)基（我以為加血清過于粘稠，不宜吹打，加培養(yǎng)基后稀釋胰酶可不斟酌對細(xì)胞的損傷），奏樂成單個細(xì)胞；

　　3、接種時要注意細(xì)胞密度，多數(shù)細(xì)胞請求0.5-2的10的4次冪，這也要摸索一下（簡略：就是你種一個密度，如果在你測指標(biāo)時細(xì)胞沒過多影響結(jié)果就行）；

　　4、周邊的孔不要做指標(biāo)檢測孔，你有沒有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細(xì)胞2天后狀態(tài)就顯明不好了；

　　5、接種細(xì)胞調(diào)劑好濃度后，要一邊吹細(xì)胞懸液一邊接種；

　　6、還有你說看不清細(xì)胞，你注意到?jīng)]有，當(dāng)把培養(yǎng)板那出孵箱一會，培養(yǎng)板蓋就有一層霧，會影響視察細(xì)胞，你是不是這個問題？？

　　問：我在96孔培育板上接種的細(xì)胞很均勻，但換液時，我用槍加150ul的造就基參加每個孔內(nèi)，成果在顯微鏡下察看周邊細(xì)胞全被沖到孔中心往了，而中間的細(xì)胞層疊成致密的團(tuán)塊.請問這樣的細(xì)胞對試驗(yàn)有影響嗎?有其他的好措施嗎? 是3T3-L1前脂肪細(xì)胞，要進(jìn)行引誘分化成成熟脂肪細(xì)胞。所以我每次換液總把握不好。請問有誰有這方面的經(jīng)驗(yàn)嗎?

　　答：我們試驗(yàn)室一般用機(jī)械吸引器吸引，吸引器管前面套一個20ul加樣器的Tip頭，后果不錯，操作在無菌臺內(nèi)進(jìn)行。Tip頭剪往尖端后滅菌應(yīng)用，加液時液體呈滴狀滴進(jìn)，就不會擾動孔底的細(xì)胞了。

　　3T3-L1前脂肪細(xì)胞不是貼壁的嗎？怎么會這么輕易被沖到中間去？

　　我只聽說過第一次把細(xì)胞加到孔中的時候很輕易讓細(xì)胞長得不均勻，3T3-L1前脂肪細(xì)胞要是貼壁了不容易被沖走了吧，要不然就不要用胰酶消化了，呵呵??！

　　建議：加液的時候沿著邊輕輕的參加，動作柔和，可以避免激動細(xì)胞；往液的時候直接甩板，便利快捷。

　　去液的時候不建議直接甩板，容易污染?？梢约舻魌ip尖，不能直接沖細(xì)胞，沿孔壁輕輕加入，液體提前在孵箱里預(yù)熱10分鐘，有時候液體涼也會使細(xì)胞掉下來。

　　是換完液馬上就卷了，還是過一會兒才卷的？我感到這個細(xì)胞狀況不好的時候是容易卷的，我誘導(dǎo)后換保持培養(yǎng)液時細(xì)胞卷的很厲害，本來也認(rèn)為是換液造成的，后來察看了一下不是。你在細(xì)心剖析一下，一定是換液造成的馬？一般帖壁細(xì)胞換液時即使是沖也只是一小部分破掉，不會大面積掉下來的，我以為。

　　換完液馬上就卷了，細(xì)胞好象是一大片全掉下來拉，并在浮動，然后我第二天在看時就發(fā)明細(xì)胞全堆在中間，我也沒在意，持續(xù)換液.但現(xiàn)在是我把細(xì)胞從培養(yǎng)箱里拿出來肉眼就能看到每個孔中間有一個小白點(diǎn).我認(rèn)為是污染了，拿到顯微鏡下看又不太像，自己感到是細(xì)胞疊在一起長的太密了.由于能看到很致密的細(xì)胞團(tuán).而周圍的細(xì)胞輪廓很清楚，但不是很多.為這個實(shí)驗(yàn)我已經(jīng)展了5塊96孔板了，真不想再這樣持續(xù)盲目下去.

　　我在96孔板中引誘細(xì)胞換液一般采取半量換液，這樣細(xì)胞就不會被沖走了，至于換液的間隔與細(xì)胞有關(guān)，我引誘肝細(xì)胞是隔天半量換液。假如卷得特殊厲害，很可能是細(xì)胞的問題，建議更新細(xì)胞株。

　　問：我的細(xì)胞對胰酶和ＥＤＴＡ不管用．高濃度胰酶可以，但細(xì)胞存活率不高．有沒有小的細(xì)胞刮匙，（或者自制刮匙的方式），可以用于９６孔板？（我在建細(xì)胞系，非得用９６孔板）．謝謝！

　　一般情形下細(xì)胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊，都不太好消化，如果建系的話Zui好不用刮的方式，還是消化比擬好！消化時以下幾點(diǎn)注意了嗎？

　　消化前用D-Hanks沖洗了嗎？可以沖刷2-3遍。

　　恰當(dāng)增添胰酶濃度，進(jìn)步胰酶PH值到8，減少消化時間應(yīng)當(dāng)對細(xì)胞影響不大。消化時放入37度培養(yǎng)箱。

　　如果細(xì)胞還是消化不下來可加適量膠原酶，有的細(xì)胞對膠原酶敏感。

　　市場上有買細(xì)胞刮刀，但是我用過的型號不實(shí)用與96孔。我在做96孔單克隆時一般采取酶消化法。 批準(zhǔn)上樓的說法，消化前將細(xì)胞用D-Hanks沖洗，有助與消化，另外胰酶的Zui佳消化條件是 pH 8.0，37度Zui好. 如果效果還是不太好的話，可以采取多次消化辦法。

　　問：D-Hanks和PBS沖刷效果有何不同？我在胰酶消化前一直用PBS沖刷，學(xué)生顯微鏡。

　　首先，D-Hanks和PBS沖洗細(xì)胞都可以的，我兩種都用過，不過嚴(yán)厲來說我認(rèn)為D-Hanks更好，由于我們的胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不轉(zhuǎn)變胰酶的消化環(huán)境。

　　第二個問題，完整可以不用wash，加入帶血清的培養(yǎng)基之后胰酶將完整沒有作用，我一般都是這樣做的，但是如果EDTA濃度太高的話就須要wash了！

　　培養(yǎng)板的包被及相干問題：為了適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)須要，可對培養(yǎng)板用不同的物資進(jìn)行包被后應(yīng)用，這其中有增進(jìn)細(xì)胞黏附的，也有用于一些特別檢測須要的。不同的試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)可能具體的計劃亦不同，依據(jù)需要機(jī)動控制。


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