顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　 中度嗜熱浸礦微生物的富集、培養(yǎng)及馴化

　　中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院 曾偉民

　　1.1 引言

　　目前生物濕法冶金范疇中常用的浸礦菌種為氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）、氧化硫硫桿菌（Acidithiobacilus thiooxidans）和氧化亞鐵鉤端螺旋菌（Leptospirillum ferrooxidans），它們的合適生長(zhǎng)溫度為 28℃-40℃，這些中溫菌已在金、銅、鋅、鈾等的生物提取上獲得了必定的運(yùn)用。然而這些中溫浸礦微生物對(duì)龐雜浸礦環(huán)境（重金屬含量高、存在有毒砷離子、高溫等）的適應(yīng)性有限，如礦物氧化放熱導(dǎo)致浸出槽和浸礦堆中經(jīng)常發(fā)生較高的溫度，采用中溫菌浸出速度慢、浸出率低，而且對(duì)某些難溶礦如黃銅礦等不能連續(xù)浸出，使得生物浸礦的產(chǎn)業(yè)利用并不廣泛。

　　20世紀(jì)90年代，人們開(kāi)始器重高溫菌浸礦的研討和運(yùn)用。這些高溫菌包含中度嗜熱菌，Zui佳生長(zhǎng)溫度45℃-60℃，重要有Sufobacillus菌屬；極度嗜熱菌，Zui佳生長(zhǎng)溫度60℃-85℃，重要有Sulfolobus和Sulfolobus like archaea等。研討表明，高溫條件下（50℃-80℃）高溫菌不僅可以明顯地提高浸出反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，加快反應(yīng)速度，縮短浸出周期；而且可以防止黃銅礦等部分原生硫化礦的過(guò)度鈍化阻礙浸出反應(yīng)的進(jìn)行，Zui終極大地提高浸出速率和浸出率。而其中的中度嗜熱菌較極度嗜熱菌能耐受更高的金屬離子濃度和礦漿濃度，因此在生物冶金利用中具有更大的潛力。本章旨在收集中國(guó)多個(gè)銅礦山礦坑水和礦泥樣品，采用多種培養(yǎng)基（以硫和亞鐵為能源物質(zhì)）富集中度嗜熱微生物并優(yōu)化其生長(zhǎng)條件，然后將擴(kuò)大培養(yǎng)后的浸礦微生物進(jìn)行對(duì)高金屬離子濃度和高黃銅礦礦漿濃度的馴化實(shí)驗(yàn)。

　　1.2 資料與方式

　　1.2.1 浸礦菌種采集

　　中度嗜熱浸礦微生物固然Zui佳生長(zhǎng)溫度在45℃-60℃之間，但是依然能在中溫環(huán)境下與中溫菌一起存在（28℃左右）。因此各種露天的銅硫化礦及煤礦的酸性礦坑水是適合且便利的樣品采集點(diǎn)。

　　采集樣品時(shí)，用pH試紙測(cè)試礦坑水的pH值，如pH在1.0-4.0之間，且水樣色彩呈紅棕色（Fe3+的色彩）或藍(lán)色（Cu2+的色彩），則闡明該礦坑水中可能有浸礦微生物的存在。采集的水樣不能太滿，須留一定空間存空氣，并爭(zhēng)奪能在一個(gè)星期內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行富集和培養(yǎng)。

　　本實(shí)驗(yàn)所用的浸礦微生物采集于江西德興銅礦，廣東大寶山銅礦，安徽銅陵銅礦，廣東玉水硫銅礦，湖南郴州煤礦等礦山的礦坑水中，在進(jìn)行富集培養(yǎng)前，將上述所有礦坑水混合，然后采用多種培養(yǎng)基富集中度嗜熱浸礦微生物。

　　1.2.2 菌種的富集造就

　　將混雜后的礦坑水采用改良后的9K培養(yǎng)基（(NH4)2SO4 3.0 g/L, Na2SO4 2.1 g/L, MgSO47H2O 0.5 g/L, K2HPO4 0.05 g/L, KCl 0.1 g/L 和Ca(NO3)2 0.01 g/L）進(jìn)行中度嗜熱浸礦微生物的富集。

　　取150mL的上述培養(yǎng)基于500mL的錐形瓶中，參加50mL混雜后的礦坑水，然后添加20 g/L的硫酸亞鐵和5g/L的單質(zhì)硫。初始pH值由1：1的硫酸調(diào)至pH 2.0。富集試驗(yàn)在45度的搖床中進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速為 180 r/min。培養(yǎng)至第三天時(shí)，再次接種30mL的混合礦坑水，讀數(shù)顯微鏡價(jià)格，培養(yǎng)至第七天時(shí)，再次接種20mL礦坑水。菌種培養(yǎng)進(jìn)程中采取計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下察看微生物數(shù)目，當(dāng)菌種數(shù)目達(dá)到107 個(gè)/mL時(shí)，進(jìn)行傳代造就。

　　傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣為改良9K，培養(yǎng)溫度45度，初始pH值為2.0，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。接種菌為上一次富集后的微生物，接種量為10%。經(jīng)過(guò)2-3次的傳代培養(yǎng)后，菌種數(shù)目達(dá)到108 個(gè)/mL，此時(shí)開(kāi)始進(jìn)行菌種生長(zhǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.3 菌種的生長(zhǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

　　1.2.3.1 菌株Zui適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

　　將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中度嗜熱富集物按5%的接種量接種到改良9K培養(yǎng)基中(接種后菌體濃度為2.0×106個(gè)/mL -3.0×106個(gè)/mL)。分辨置于39℃、42℃、45℃、48℃、51℃和54℃，180 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，直至細(xì)菌進(jìn)進(jìn)穩(wěn)定生長(zhǎng)期。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（下同），視察不同溫度下中度嗜熱富集物的生長(zhǎng)情況。

　　1.2.3.2 菌株Zui適初始pH值的測(cè)定

　　用1：1硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，分辨為：0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2和3.4。接種5%處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中度嗜熱富集物，置于48℃，180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)3天。測(cè)定初始pH值對(duì)該富集物生長(zhǎng)的影響。

　　1.2.3.3 有機(jī)物對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

　　在48℃，初始pH2.0的條件下，分辨添加三種不同濃度的酵母粉、蛋白胨和葡萄糖（0 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L和0.8 g/L）到造就基中，接種5%處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中度嗜熱富集物，置于180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)6天?？己擞袡C(jī)物對(duì)該富集物生長(zhǎng)的影響。

　　1.2.4 菌種的擴(kuò)展培養(yǎng)

　　菌種的擴(kuò)展培養(yǎng)在一個(gè)3L的攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行（圖2.1），機(jī)械攪拌速度為500 r/m。反應(yīng)器置于恒溫槽中，以堅(jiān)持浸礦溫度（48度）的恒定。通過(guò)空氣泵往反應(yīng)器內(nèi)泵進(jìn)空氣，速度為360mL/min。反應(yīng)器內(nèi)蒸發(fā)喪失的水分通過(guò)恒流泵持續(xù)流加蒸餾水來(lái)彌補(bǔ)。

　　參加1950mL的改進(jìn)9K培養(yǎng)基，接種50mL中度嗜熱富集物，添加30 g/L的硫酸亞鐵和8g/L的單質(zhì)硫作為能源物質(zhì)。采用1：1的硫酸調(diào)節(jié)溶液的初始pH值至2.0。天天用計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡 （Olympus CX31）下檢測(cè)溶液中的菌種數(shù)目，天天用pH計(jì)(pH S-3C 酸度計(jì))檢測(cè)溶液pH值的變更情況。

　　1.2.5 中度嗜熱富集物對(duì)高黃銅礦礦漿濃度的馴化

　　黃銅礦的馴化實(shí)驗(yàn)在攪拌反響器中進(jìn)行。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中度嗜熱富集物接種到改進(jìn)9K培養(yǎng)基中，接種量為10％，另外參加10 g/L 的硫酸亞鐵，3 g/L的單質(zhì)硫和5 g/L的黃銅礦精礦（礦物成分及含量見(jiàn)表2.1）。用1：1的硫酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，培養(yǎng)溫度為48度。由于黃銅礦浸出初期耗酸比擬多，因此在培養(yǎng)初期采取1：1硫酸調(diào)節(jié)溶液pH值堅(jiān)持在2.0，直至浸礦液中的產(chǎn)酸量高于耗酸量；在培養(yǎng)后期，當(dāng)溶液pH值降至1.6左右，且培養(yǎng)液中菌體濃度超過(guò)108個(gè)/mL時(shí)，過(guò)濾除渣，收集浸出液，并進(jìn)行第二次菌種馴化。

　　第二次馴化條件跟第一次相似，只是將能源物質(zhì)中硫酸亞鐵和單質(zhì)硫的含量分離下降到3 g/L和1 g/L，但將黃銅礦的礦漿濃度提高到10 g/L。大概培養(yǎng)2周，當(dāng)溶液中的菌種濃度超過(guò)108個(gè)/mL時(shí)，過(guò)濾除渣，收集浸出液，并進(jìn)行第三次菌種馴化。

　　第三次馴化進(jìn)程中不再添加亞鐵和單質(zhì)硫作為能源物質(zhì)，僅以12 g/L的黃銅礦為能源物質(zhì)。此次培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)延伸至大約20天，當(dāng)溶液中的菌種濃度超過(guò)108個(gè)/mL時(shí)，過(guò)濾除渣，收集浸出液并用做下次馴化的接種液。此后不斷反復(fù)第三次馴化進(jìn)程，直至中度嗜熱富集物在只有黃銅礦（12 g/L）作為能源物質(zhì)的條件下能在10天內(nèi)達(dá)到Zui大菌種密度。

　　當(dāng)中度嗜熱富集物能在12 g/L的黃銅礦礦漿濃度下生長(zhǎng)較好時(shí)，將該富集物接種于含16 g/L黃銅礦的礦漿中，然后反復(fù)上述步驟，依次接種于21 g/L 、28 g/L、 37 g/L 、50 g/L和80 g/L的黃銅礦礦漿中，直至該中度嗜熱富集物能耐受80 g/L黃銅礦礦漿。并在8％礦漿濃度下，接種未馴化菌作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)礦漿濃度下，當(dāng)銅浸出率趨于穩(wěn)固時(shí)，視為該浸出實(shí)驗(yàn)停止，并測(cè)定浸出液中Cu2＋和Pb2＋的濃度。Cu2＋和Pb2＋離子濃度通過(guò) ICP-OES測(cè)定。

　　1.3 成果與討論

　　1.3.1 中度嗜熱微生物的富集培育及其生長(zhǎng)參數(shù)優(yōu)化

　　以亞鐵和單質(zhì)硫?yàn)槟茉次镔Y，在搖瓶中采取改進(jìn)9K培育基不斷富集中度嗜熱浸礦微生物，終極微生物的Zui大菌種濃度到達(dá)1.4×108 個(gè)/mL。通過(guò)光學(xué)顯微鏡察看，發(fā)明該富集物的菌種形態(tài)不一，有長(zhǎng)桿狀、螺旋狀和橢球狀等類型，應(yīng)為多種微生物的混雜體。為了進(jìn)一步優(yōu)化該富集物的生長(zhǎng)參數(shù)，我們研討了不同生長(zhǎng)溫度，不同初始pH值，不同有機(jī)物種類和濃度下微生物的生長(zhǎng)情形。

　　1.3.1.1 溫度對(duì)中度嗜熱富集物生長(zhǎng)的影響

　　實(shí)驗(yàn)考察了中度嗜熱富集物在初始pH值為2.0但不同溫度下（35℃，39℃，45℃，48℃，51℃，54℃和60℃）的生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)溫度為48℃時(shí)，培養(yǎng)6天后的微生物進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌種濃度達(dá)到約2.4×108個(gè)/mL； 45℃和51℃時(shí)，菌種濃度相對(duì)48℃時(shí)有必定水平的下降；39℃和54℃時(shí)，菌體濃度都在5 ×107個(gè)/mL以下，而且該菌進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)光分離延遲到14天和10天，表明菌的生長(zhǎng)受到很大克制；另外該富集物在60℃和35℃下均無(wú)生長(zhǎng)。因此得出該中度嗜熱富集物的Zui適生長(zhǎng)溫度為48℃。

　　1.3.1.2 初始pH值對(duì)中度嗜熱富集物的生長(zhǎng)影響

　　實(shí)驗(yàn)考核了中度嗜熱富集物在生長(zhǎng)溫度為48℃但初始pH值不同的條件下的生長(zhǎng)情況。如圖2.2所示，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，中度嗜熱微生物的菌種濃度約為2.4×107個(gè)/mL，浮現(xiàn)Zui佳生長(zhǎng)狀況；當(dāng)pH值高于3.0時(shí)，該菌基礎(chǔ)上無(wú)生長(zhǎng)，甚至逝世亡，表明相對(duì)較高的pH值會(huì)克制該菌的生長(zhǎng)；當(dāng)pH值低于1.4時(shí)，該菌仍具有必定的生長(zhǎng)活性，菌體濃度為0.6－2.8×107個(gè)/mL，表明其嗜酸性較強(qiáng)。文獻(xiàn)報(bào)道：生物浸出黃銅礦末期，由于浸出液中Fe3+的還原和S0的氧化，發(fā)生大批的酸，導(dǎo)致溶液終極的浸出液pH值能降到1.3左右，此時(shí)只有嗜酸性強(qiáng)的微生物才干存活下來(lái)。由此可見(jiàn)，該中度嗜熱富集物的高度嗜酸性為其有效浸出黃銅礦供給了可能。

　　1.3.1.3 有機(jī)物對(duì)中度嗜熱富集物生長(zhǎng)的影響

　　實(shí)驗(yàn)考核了在生長(zhǎng)溫度為48℃，初始pH值為2.0的條件下，添加不同濃度的酵母粉、蛋白胨和葡萄糖后中度嗜熱富集物的生長(zhǎng)情況。成果表明：加入葡萄糖后不久，微生物的生長(zhǎng)受到克制，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)菌生長(zhǎng)量不斷減少，甚至逝世亡；但是酵母粉和蛋白胨的加入能較大水平提高該菌的生長(zhǎng)量，當(dāng)添加0.4 g/L的酵母粉和蛋白胨時(shí)，細(xì)菌菌體濃度分離達(dá)到了3.6×107個(gè)/mL 和4.1×108個(gè)/mL。因此，添加適量的含氮有機(jī)物如酵母粉和蛋白胨，有利于中度嗜熱微生物的生長(zhǎng)。

　　1.3.1.4 中度嗜熱富集物的生長(zhǎng)曲線

　　綜合以上優(yōu)化后的生長(zhǎng)參數(shù)，在pH值為2.0，溫度為48℃條件下，添加0.4 g/L的蛋白胨，20 g/L除菌的FeSO4和5 g/L除菌的單質(zhì)硫，接種5%處于穩(wěn)固生長(zhǎng)期的中度嗜熱富集物，置于180 r/min 轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，察看微生物的生長(zhǎng)情形。

　　優(yōu)化生長(zhǎng)參數(shù)后的中度嗜熱富集物的生長(zhǎng)曲線如圖2.4。成果表明：接種后的2天內(nèi)，該菌處于適應(yīng)階段，菌體濃度低于5×107個(gè)/mL。從第3天開(kāi)端，微生物的生長(zhǎng)開(kāi)端加速，并于第四天進(jìn)入指數(shù)增加期，到第7天時(shí)，中度嗜熱富集物進(jìn)進(jìn)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，此時(shí)菌種濃度接近Zui大，約為4.3×108個(gè)/mL。穩(wěn)定期的時(shí)光較短，只延續(xù)到第11天，之后培養(yǎng)液中微生物數(shù)目不斷減少。

　　通過(guò)生長(zhǎng)參數(shù)優(yōu)化后的中度嗜熱微生物，在7天內(nèi)能達(dá)到Zui大菌種濃度（4.3×108個(gè)/mL），相對(duì)沒(méi)有進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化（45 ℃，初始pH2.0）的菌體濃度（2.4×108個(gè)/mL），有了較大的提高。

　　1.3.2 中度嗜熱富集物對(duì)高黃銅礦礦漿濃度的馴化 當(dāng)中度嗜熱富集物從搖瓶中接種到攪拌反映器中進(jìn)行擴(kuò)展培育時(shí)，微生物的生長(zhǎng)速度相對(duì)搖瓶中有了較大的進(jìn)步，這是由于攪拌反響器能為微生物供給更充分的氧氣和二氧化碳，并且使溶液的 勻質(zhì)后果更好。以亞鐵和單質(zhì)硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)，該富集物在攪拌反映器中能在5天內(nèi)到達(dá)Zui大菌種濃度，為7.8×108個(gè)/mL。但是當(dāng)直接僅以黃銅礦為能源物質(zhì)時(shí)，該富集物的生長(zhǎng)速度非常遲緩，銅的浸出后果非常不幻想，因此必需進(jìn)行中度嗜熱微生物對(duì)黃銅礦的馴化。 通過(guò)不斷減少溶液中的亞鐵和硫兩類能源物資，但遲緩增添黃銅礦的含量，中度嗜熱富集物對(duì)黃銅礦的適應(yīng)性不斷加強(qiáng)。到Zui后溶液中僅以黃銅礦為能源物質(zhì)時(shí)，中度嗜熱微生物在20天內(nèi)的菌種濃度接近8 ×107個(gè)/mL。這表明該富集物已經(jīng)開(kāi)端能浸出黃銅礦，并從中獲得生長(zhǎng)所需的能源物資如亞鐵和硫。

　　為了進(jìn)一步加強(qiáng)中度嗜熱富集物對(duì)黃銅礦的耐受才能，本實(shí)驗(yàn)考核了該富集物在不斷增添黃銅礦礦漿濃度后的生長(zhǎng)情形和銅的浸出才能。圖2.5 為馴化試驗(yàn)中中度嗜熱微生物在不同礦漿濃度下的銅浸出率。隨著礦漿濃度的增長(zhǎng)，黃銅礦的浸出率有了較大的降落，但是銅浸出率到達(dá)穩(wěn)固的時(shí)光卻不斷增添。

　　當(dāng)黃銅礦礦漿濃度為10 g/L時(shí)，銅浸出率為94%，浸出時(shí)間僅為7天。然而當(dāng)黃銅礦礦漿濃度增加到80 g/L時(shí)，銅浸出率下降到74%，浸出時(shí)間延伸至42天。

　　在攪拌反映器中，黃銅礦礦漿濃度的增長(zhǎng)會(huì)增長(zhǎng)反響體系的剪切力，從而嚴(yán)重影響微生物的生長(zhǎng)。另外，在高礦漿濃度下，固然銅的浸出率相對(duì)較低，但銅離子和鐵離子的濃度卻比低礦漿濃度時(shí)高出很多，高濃度的金屬離子同樣不利于微生物的生長(zhǎng)。盡管如此，相比沒(méi)有馴化的中度嗜熱富集物（80 g/L 礦漿濃度下銅浸出率僅為24%），馴化微生物對(duì)礦漿濃度的耐受性和浸出黃銅礦的能力都有了很大的進(jìn)步。

　　1.4 小結(jié)

　　（1） 從中國(guó)多個(gè)銅礦山的礦坑水中勝利富集到一種中度嗜熱混合物，并對(duì)其生長(zhǎng)條件如溫度，初始pH值，有機(jī)物應(yīng)用等進(jìn)行了優(yōu)化，終極在以亞鐵和單質(zhì)硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)，改良9K無(wú)機(jī)鹽為培養(yǎng)基，生長(zhǎng)溫度為48度，初始pH值為2.0，并添加0.4 g/L的蛋白胨后，該富集物在搖瓶中7天內(nèi)能達(dá)到Zui大菌種濃度為4.3×108個(gè)/mL，在攪拌反應(yīng)器中的5天內(nèi)能達(dá)到Zui大菌種濃度為7.8×108個(gè)/mL。

　?。?） 經(jīng)過(guò)中度嗜熱富集物對(duì)黃銅礦的不斷馴化，該富集物在80 g/L的黃銅礦礦漿濃度下生長(zhǎng)良好， 42天內(nèi)銅的浸出率為74%。相比未馴化菌而言（42天內(nèi)銅浸出率僅為24%），馴化后的中度嗜熱富集物對(duì)黃銅礦的浸出才能有了相當(dāng)大的進(jìn)步。


本文地址:http://www.hkxccw.cn/news/315.html
出自: 顯微鏡報(bào)價(jià)網(wǎng) 轉(zhuǎn)載時(shí)請(qǐng)標(biāo)明出處.