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　　六、Caspase-3活性的檢測 　　 Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中起著非常主要的作用，其中caspase-3為要害的履行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的很多道路中施展功效。Caspase-3正常以酶原（32KD）的情勢存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終極導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和逝世亡細(xì)胞，caspase-3的活性顯明降落。　　1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解?！　》椒ǎ骸　∈占?xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反響1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標(biāo)志的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)志的羊抗鼠IgG室溫反映1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色?！　〕晒篬圖9-1、圖9-2]　　2 熒光分光光度計分析　　原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。依據(jù)這一特色，設(shè)計出熒光物資偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后開釋出AMC，自由的AMC才干被激發(fā)發(fā)射熒光。依據(jù)開釋的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反應(yīng)Caspase-3被活化的水平?！　》绞剑菏斋@細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞?PBS洗滌?制備細(xì)胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反映1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長380nm，發(fā)射光波長為430-460nm）?！　〕晒篬圖10]　　3 流式細(xì)胞術(shù)剖析　　辦法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反響1h?UV流式細(xì)胞計剖析caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)和均勻熒光強(qiáng)度?！　〗Y(jié)果：[圖11] screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=176 title="Click to view full 8.jpg (687 X 189)" border=0 align=absmiddle>

　　圖9－2 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=563 height=199 title="Click to view full 8'.jpg (563 X 199)" border=0 align=absmiddle>

　　圖10－－ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=397 title="Click to view full 9.jpg (742 X 461)" border=0 align=absmiddle>

　　圖11－－ （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖）

　　七、凋亡相干蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位剖析 　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功效研究表明，它是增進(jìn)細(xì)胞凋亡的加強(qiáng)劑。應(yīng)用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡進(jìn)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)明，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并呈現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，隨同著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變更，連續(xù)較長時光，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)明，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片斷化，提醒TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期產(chǎn)生的事件之一。進(jìn)一步的研討證實，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有廣泛意義，不同細(xì)胞凋亡早期均涌現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研討細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，供給了一種新的技巧和指標(biāo)?！　。ㄒ唬㏕FAR19蛋白的細(xì)胞定位分析　　資料試劑：FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。　　儀器：低溫水平離心機(jī), 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞計　　方式：　　1 懸浮細(xì)胞的染色：　?。?）收獲正常和引誘凋亡的細(xì)胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min?！　。?）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　?。?）加進(jìn)PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。　?。?）加進(jìn)200ml胎牛血清，室溫反響30min。　?。?）加進(jìn)5ml FITC標(biāo)志的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應(yīng)30min　?。?）熒光細(xì)胞洗液洗2次，1000rpm′10min。成果察看：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下察看TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時用流式細(xì)胞計定量檢測TFAR19蛋白的均勻熒光強(qiáng)度。[圖12]　　2：貼壁細(xì)胞的原位染色　?。?） 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞展在24孔或6孔板中（內(nèi)有干凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%~80%滿時，凋亡引誘劑處理細(xì)胞?！　。?） 將不同時光點處置的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上?！　。?） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡視察TFAR19在細(xì)胞中的定位?！　〗Y(jié)果視察：[圖13]　　3：臨床病理切片的染色、檢測。　　4：原代細(xì)胞的培育、檢測?！　?：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的散布及定位　　（二）TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病　　1． ELISA法檢測正凡人和疾病狀況下，以及疾病的不同時代，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平?！　≠Y料和試劑：　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer　　2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20　　3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）　　4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g檸檬酸 0.51g DDW 100ml　　6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml　　7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板機(jī) 　　操作步驟　　1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）。　　2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C過夜?！　?. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個反復(fù)孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對比?！　?. 洗滌Buffer洗板三次，參加1：2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h?！　?. 洗滌Buffer洗板三次，參加顯色液，100 ml/well，避光反映10~15min?！　?. 加入H2SO4終止反應(yīng)，50 ml/well?！　?. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比擬病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達(dá)程度?！　?． Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=479 height=317 title="Click to view full 11.jpg (479 X 317)" border=0 align=absmiddle>

　　圖13－－ （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖）

　　真的不錯，謝謝！?。。?

　　受益非淺！非常感激！

　　thank you very much!I learn a lot from it .

　　eeflying以為很強(qiáng)的說。

　　請教midas：我籌備檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，請您具體先容一下各種方法的特色，如檢出率、破費，哪種辦法比擬合適研討生做等，多謝！

　　我要樂瘋了，感激主人??！

　　有一個迷惑的問題：在我看來，細(xì)胞流式儀檢測凋亡既可以定性又可以定量，那為什么盡大多數(shù)試驗室仍要同時用TUNEL法來進(jìn)行定性呢？而且，現(xiàn)在對于TUNEL法檢測凋亡存在必定的爭議：并不是只有產(chǎn)生凋亡的細(xì)胞表示TUNEL（＋）。那么對細(xì)胞凋亡的檢測是否只需細(xì)胞流式儀就足夠了呢？

　　太信服主人了！既有程度又有高貴的品德，我要向您們學(xué)習(xí)！

　　太信服主人了！既有程度又有高貴的品德，我要向您們學(xué)習(xí)！

　　請問hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342主要用于懸浮細(xì)胞，而hoechst33258重要用于貼壁細(xì)胞？如果我用hoechst33258和PI做雙標(biāo)，應(yīng)當(dāng)怎么辦特殊是 細(xì)胞怎么處置？謝謝

　　dinki wrote:有一個迷惑的問題：在我看來，細(xì)胞流式儀檢測凋亡既可以定性又可以定量，那為什么盡大多數(shù)試驗室仍要同時用TUNEL法來進(jìn)行定性呢？而且，現(xiàn)在對于TUNEL法檢測凋亡存在一定的爭議：并不是只有產(chǎn)生凋亡的細(xì)胞表示TUNEL（＋）。那么對細(xì)胞凋亡的檢測是否只需細(xì)胞流式儀就足夠了呢？我以為：由于目前除了電鏡是檢測凋亡的金尺度外，其他的方式均有必定的不足，所以一般都會用到兩種以上的方法對細(xì)胞調(diào)亡進(jìn)行檢測，如：流式＋熒光染色，熒光染色＋DNAladder等等。TUNEL的方法是體內(nèi)實驗時檢測調(diào)亡的常用辦法，而流式對體內(nèi)細(xì)胞的調(diào)亡則無能為力。

　　jchenone wrote:請問hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342重要用于懸浮細(xì)胞，而hoechst33258重要用于貼壁細(xì)胞？假如我用hoechst33258和PI做雙標(biāo)，應(yīng)當(dāng)怎么辦特殊是 細(xì)胞怎么處置？謝謝hoechsts33258，hoechst33342二者差別不大，但是hoechst33342對細(xì)胞的毒性作用更小一些，所以一般來說hoechsts33258用于細(xì)胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對活細(xì)胞直接進(jìn)行染色！這么說來，假如您用hoechst和PI做對活細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)，那么就Zui好選擇hoechst33342，這是就可以直接將染料參加培育液中，之后固定察看；但是假如必定要用hoechsts33258，那么就Zui好是：固定－－>染色－－>視察。

　　我Zui近的實驗很不順，我將載玻片用左旋多聚賴氨酸包被后放與六孔板中，但是很輕易污染，不知各位高手有何高招．

　　XSQ wrote:我Zui近的試驗很不順，我將載玻片用左旋多聚賴氨酸包被后放與六孔板中，但是很輕易污染，不知各位高手有何高招．載玻片、PLL、六孔板、造就液及玻片確保無菌，Zui主要的無菌操作技巧！

　　講的太出色了，好！

　　好極！我要做原代非決裂細(xì)胞的凋亡檢測，不知主任有沒好的建議，還有，不知哪位高手做過Sertoli Cell的原代培育，很想請教！

　　請問caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的具體進(jìn)程是怎樣的？

　　細(xì)胞凋亡的圖片1電鏡 （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖）

　　細(xì)胞凋亡的圖片2電鏡 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=190 height=250 title="Click to view full apop5掃描電竟.gif (190 X 250)" border=0 align=absmiddle>


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