數(shù)碼熒光顯微鏡使用過程中過濾不需要的熒光
先進(jìn)的顯微鏡使新的CRISPR-Cas系統(tǒng)大放異彩
Whitney L. Johnson , Aaron F. Straight , 細(xì)胞生物學(xué)方法, 2013
顯微鏡使用中減少不需要的熒光
來自感興趣的 FP 以外的其他來源的熒光可能會掩蓋相關(guān)的熒光信號。一些最常見的有害熒光來源是成像介質(zhì)的添加劑。培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基通常含有 pH 指示劑，例如酚紅熒光或血清成分，以及富含酵母和細(xì)菌的培養(yǎng)基也含有大量不需要的熒光。由于樣品浸泡在成像介質(zhì)中，即使是介質(zhì)中微弱的熒光成分也會掩蓋對所需熒光信號的檢測。通常不可能排除所有有助于培養(yǎng)基熒光的成分；然而，使用不含添加劑的培養(yǎng)基（如酚紅）或不含熒光成分的特定培養(yǎng)基可以消除重要的不需要的熒光來源。
不想要的熒光的第二個主要來源是樣品本身的自發(fā)熒光。有許多具有內(nèi)在熒光的細(xì)胞區(qū)室和組織的例子，例如胚胎中的卵黃血小板、植物中的葉綠體和真菌中的液泡區(qū)室等等。這些固有熒光源通常無法去除；然而，我們可以選擇合適的濾光片就可以過濾掉它們。
熒光團(tuán)在被稱為光漂白的過程中被照射時會失去發(fā)熒光的能力。當(dāng)熒光分子從熒光期間激發(fā)的電子累積化學(xué)損傷時，就會發(fā)生光漂白。光漂白會嚴(yán)重限制通過熒光顯微鏡觀察樣品的時間。有幾種技術(shù)可以減少光漂白，例如使用更堅固的熒光團(tuán)、通過最小化照明或使用光保護(hù)清除劑化學(xué)品。
帶有熒光報告蛋白的熒光顯微鏡能夠通過熒光顯微鏡分析活細(xì)胞，但是細(xì)胞容易受到光毒性的影響，尤其是短波長光。此外，熒光分子在光照下會產(chǎn)生反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)，從而增強(qiáng)光毒性效應(yīng)。
與透射和反射光顯微鏡技術(shù)不同，熒光顯微鏡僅允許觀察已標(biāo)記為熒光的特定結(jié)構(gòu)。例如，通過熒光顯微鏡觀察用熒光 DNA 染色劑制備的組織樣本只能揭示細(xì)胞內(nèi) DNA 的組織結(jié)構(gòu)，而不能揭示細(xì)胞形態(tài)的其他信息。
建議從非熒光圖像（例如明場）估計熒光信號的計算技術(shù)可以減少這些問題。[8]一般來說，這些方法涉及在染色細(xì)胞上訓(xùn)練深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，然后估計未染色樣品上的熒光。因此，通過將研究中的細(xì)胞與用于訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞解耦，成像可以更快地進(jìn)行并且光毒性降低。