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　　實驗五 細菌菌落視察及生化鑒定實驗、微生物的染色技巧

　　實驗項目性質(zhì)：綜合設計實驗

　　所屬課程名稱：《水處置微生物學實驗》

　　實驗打算學時：4 學時

　　一、細菌菌落觀察

　　1 實驗目標

　　察看細菌的菌落形態(tài)。

　　2 試驗原理

　　菌落形態(tài)是指某種微生物在必定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細菌在必定培

　　養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特點，應用察看這些特點，來區(qū)分各大類微生物及初

　　步辨認、鑒定微生物。

　　3 材料

　　實驗四中已經(jīng)分別培育的細菌。

　　4 內(nèi)容

　　觀察已知細菌菌落的形態(tài)、大小、色澤、透明度、致密度和邊沿等特征。

　　5 成果

　　記載細菌的菌落特點。

　　二、細菌生化鑒定實驗【以過氧化氫酶（接觸酶）試驗為例】

　　1 實驗目的

　　控制細菌過氧化氫酶實驗方式。

　　2 實驗原理

　　具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫天生水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧呈現(xiàn)氣泡。

　　3 資料

　　3%過氧化氫溶液；實驗四中已經(jīng)分別培養(yǎng)的細菌菌落。

　　4 方式

　　取菌體置于干凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫，立即觀察結(jié)果。

　　5 成果

　　有大批氣泡發(fā)生者為陽性。不產(chǎn)賭氣泡者為陰性。

　　三、微生物染色技巧

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　　1 實驗目的

　　1.1 學習微生物涂片、染色的基礎(chǔ)技術(shù)。

　　1.2 控制細菌的簡略染色法。

　　1.3 初步認識細菌的形態(tài)特征，鞏固學習油鏡的應用辦法和無菌操作技巧。

　　2 實驗原理

　　細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基礎(chǔ)技術(shù)。細菌的細胞小而透明，在普通的

　　光學顯微鏡下不易辨認，必需對它們進行染色。應用單一染料對細菌進行染色，使經(jīng)染色后

　　的菌體與背景形成顯明的色差，從而能更明白地視察到其形態(tài)和構(gòu)造。此法操作簡便，實用

　　于菌體一般外形和細菌排列的觀察。

　　常用堿性染料進行簡略染色，這是由于在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶

　　負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容

　　易與細菌聯(lián)合使細菌著色。經(jīng)染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對照，在顯微鏡下更易于

　　辨認。常用作簡略染色的染料有美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等。

　　當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH 降落時，細菌所帶正電荷增添，此時可用伊紅、酸性

　　復紅或剛果紅等酸性染料染色。

　　染色前必需固定細菌。其目標有二：一是殺逝世細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增添其

　　對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方式。固定時盡量保持細胞原有的形態(tài)。

　　3 資料

　　3.1 菌種

　　枯草芽孢桿菌12～18h 營養(yǎng)瓊脂斜面造就物、金黃色葡萄球菌約24h 養(yǎng)分瓊脂斜面培育

　　物、大腸桿菌24h 養(yǎng)分瓊脂斜面造就物、面包酵母瓊脂斜面培育物。試驗教師可依據(jù)具體情

　　況供給適合的菌種。

　　3.2 染色劑

　　呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)，石炭酸復紅染液。

　　3.3 儀器或其他用具

　　顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，

　　生理鹽水或蒸餾水等。

　　4 流程

　　涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。

　　5 步驟

　　5.1 涂片

　　取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸餾水)于玻片中

　　央，用接種環(huán)以無菌操作，分辨從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌

　　苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體造就物)涂片，可用接種環(huán)挑取2～3 環(huán)

　　直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。

　　5.2 干燥

　　室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太

　　近，因溫度太高會損壞菌體形態(tài)。

　　5.3 固定

　　如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，辦法同干燥。 涂片、干燥和熱固定。

　　5.4 染色

　　將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2 滴于涂片上(染液恰好籠罩涂片薄膜為宜)。

　　呂氏堿性美藍染色1～2min，石炭酸復紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min 。

　　5.5 水洗

　　傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖刷，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時，

　　不要水流直接沖刷涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。

　　5.6 干燥

　　甩往玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。

　　5.7 鏡檢

　　涂片干后鏡檢。涂片必需完整干燥后才干用油鏡觀察。

　　6 結(jié)果

　　繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。

　　（二）革蘭氏染色法

　　1 試驗目標

　　1.1 懂得革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的主要性。

　　1.2 學習控制革蘭氏染色技術(shù)，鞏固學習光學顯微鏡油鏡的應用辦法。

　　2 實驗原理

　　革蘭氏染色法是1884 年由丹麥病理學家Christain Gram 氏創(chuàng)建的，革蘭氏染色法可將

　　所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細菌

　　學中Zui主要的辨別染色法。

　　革蘭氏染色法所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結(jié)

　　構(gòu)和組成不同決議的。實際上，當用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成

　　初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫聯(lián)合成結(jié)晶紫-碘的復合物，從而加強了染

　　料與細菌的聯(lián)合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色后果是不同的。革蘭氏陽性細菌的

　　細胞壁重要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細

　　胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀構(gòu)造孔徑縮小，透性下降，從而使結(jié)晶紫-碘的復合物不易被

　　洗脫而保存在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保存初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于

　　其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處置時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細

　　胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復合物比擬輕易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上

　　復染劑的紅色。

　　3 資料

　　3.1 菌種

　　大腸桿菌（ Escherichia coli ） 約24h 養(yǎng)分瓊脂斜面菌種一支， 枯草芽孢桿菌

　?。˙acillus subtilis）約16h 牛肉膏瓊脂斜面菌種一支。

　　3.2 染色劑

　　結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復紅液。

　　3.3 儀器或其他用具

　　顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蒸餾水、香柏油、二甲苯。

　　4 流程

　　涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脫色→復染）→鏡檢。

　　5 步驟

　　5.1 涂片

　　5.1.1 慣例涂片法

　　取一干凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標上菌號，并在兩端各滴一小滴蒸餾

　　水，以無菌接種環(huán)分辨挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要干凈無油，否則菌液涂不開。

　　5.2 初染

　　滴加結(jié)晶紫(以恰好將菌膜籠罩為宜)于兩個玻片的涂面上，染色1～2min ，傾去染色

　　液，細水沖刷至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。

　　5.3 媒染

　　用盧戈氏碘液媒染約l min ，水洗。

　　5.4 脫色

　　用濾紙吸往玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，

　　直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。

　　革蘭氏染色結(jié)果是否準確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的要害環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌

　　被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時光一般約20～30s。

　　5.5 復染

　　在涂片上滴加番紅液復染約2～3min ，水洗，然后用吸水紙吸干。在染色的進程中，

　　不可使染液干枯。

　　5.6 鏡檢

　　干燥后，用油鏡視察。斷定兩種菌體染色反映性。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌

　?。℅+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。

　　5.7 實驗停止后處置

　　干凈顯微鏡。先用擦鏡紙擦往鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上

　　的殘留油跡，Zui后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，涼干。

　　四、實驗結(jié)果

　　1. 記載細菌的菌落特征。

　　2. 記載待測細菌的過氧化氫酶試驗結(jié)果。

　　3. 依據(jù)觀察結(jié)果，繪出兩種細菌的形態(tài)圖。

　　4. 列表簡述兩株細菌的染色結(jié)果(菌的外形、色彩和革蘭氏染色反映)。

　　五、思考題

　　1. 哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色成果的準確性？其中Zui要害的環(huán)節(jié)是什么？

　　2. 進行革蘭氏染色時，為什么強調(diào)菌齡不能太老，用老齡細菌染色會呈現(xiàn)什么問題?

　　3. 革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰

　　性菌應分辨是什么色彩?

　　4. 不經(jīng)過復染這一步，能否差別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌？

　　5. 你以為制備細菌染色標本時，應當注意哪些環(huán)節(jié)?

　　6. 為什么請求制片完整干燥后才干用油鏡察看?

　　7. 假如涂片未經(jīng)熱固定，將會呈現(xiàn)什么問題?加熱溫渡過高、時光太長，又會怎樣呢?


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