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　　 【摘要】目標 應(yīng)用低強度間斷負壓誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向成骨細胞定向分化。方式 分別人骨髓，利用梯度離心法進行MSCs的培育，取第三代細胞應(yīng)用低強度間斷負壓誘導分化;顛倒顯微鏡下視察細胞的形態(tài)，檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色察看鈣結(jié)節(jié)形成，免疫組織化學檢測Ⅰ型膠原和骨掩護素的表達。成果 低強度間斷負壓引誘2周后，細胞浮現(xiàn)出成骨細胞形態(tài)，ALP活性顯明加強，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)形成，Ⅰ型膠原和骨維護素表達陽性。結(jié)論 利用低強度間斷負壓可以勝利的誘導MSCs向成骨細胞定向分化，誘導的細胞具有典范的成骨細胞特征。

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　　【要害詞】 負壓 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨細胞 誘導

　　Low-intensity interrupted negative pressure induces human marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts

　　Yang Zhi, Liu Miao, Zhang Yingang, Guo Xiong, Xu Peng

　　(1. Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to

　　Diseases of Ministry of Education, Institute of Environmental and Endemic Diseases,Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. School of Materials Science and Engineering,Xian Jiaotong University, Xian 710049, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年來，負壓封閉引流技巧(vacaum assisted closure, VAC)在外科創(chuàng)面處置方面取得了宏大的勝利，該項技巧能改良創(chuàng)面血供增進創(chuàng)面愈合測量顯微鏡。負壓技巧對骨組織有何作用以及作用的機制如何，能否用來增進骨折愈合、治療骨壞逝世等方面，國內(nèi)外尚無學者對其進行研討。本研討在預(yù)試驗的基本上通過察看低強度間斷負壓對人骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)引誘分化的影響，以論述其作用機制，為今后在骨折愈合和骨壞逝世方面的研討供給理論根據(jù)。

　　1 資料與方式

　　1.1 資料

　　骨髓2例取自我科診斷為髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，行人工關(guān)節(jié)置換的手術(shù)患者，年紀分辨為56歲和61歲。兩例患者肝腎功效正常，無代謝性骨病及沾染病，手術(shù)前經(jīng)患者批準，術(shù)中截骨后經(jīng)骨髓腔抽取骨髓5mL，吸進預(yù)先加有肝素的針筒備用。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco產(chǎn)品，Percoll分離液為Sigma產(chǎn)品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型膠原和骨保護素免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，完整培養(yǎng)基的組成：L-DMEM培養(yǎng)基參加100 mL/L胎牛血清，測量顯微鏡，青、鏈霉素終濃度為100 u/mL，微型負壓儀。

　　1.3 細胞原代培養(yǎng)

　　細胞采取梯度離心法進行培養(yǎng)：將抽取的骨髓分裝入離心管，參加 L-DMEM培養(yǎng)基2 mL，1 500 r/min離心5 min往除上層脂肪滴和上清，以D-Hanks液重懸細胞后平展于Percoll分別液上，1 500 r/min離心10 min，汲取中間層的白膜層(單核細胞層)，以D-Hanks液洗滌，加進L-DMEM培養(yǎng)基置入無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%(體積分數(shù))的CO2孵育箱培養(yǎng)。

　　1.4 負壓誘導

　　取第三代細胞進行負壓誘導，把24孔和6孔造就板中培養(yǎng)液預(yù)先吸掉4/5，打開蓋置進自行設(shè)計的無菌密閉容器中，容器側(cè)面有孔和導管與微型負壓儀相連，打開負壓儀設(shè)置壓力為20 kPa，30 min/次，2次/d。每次誘導完畢后取出培養(yǎng)板補足培養(yǎng)液，實驗分為負壓誘導組和正常培養(yǎng)組。

　　1.5 細胞視察

　　顛倒顯微鏡下逐日察看細胞的生長情形和形態(tài)特色，拍照記載。

　　1.6 堿性磷酸酶活性的測定

　　引誘2周后，兩組細胞用考馬斯亮蘭微板法測定每孔中細胞蛋白含量，采取堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒測定細胞ALP活性，定量測定兩組細胞中均勻每毫克蛋白質(zhì)的ALP活性變更，比擬兩組的差別。

　　1.7 茜素紅染色

　　誘導2周后，倒掉培養(yǎng)液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖刷3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下視察陽性成果。

　　1.8 免疫組織化學檢測Ⅰ型膠原和骨維護素的表達

　　誘導2周后，細胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，進行Ⅰ型膠原和骨掩護素免疫組織化學檢測，一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原和骨維護素單克隆抗體，DAB顯色。

　　1.9 統(tǒng)計學處置

　　利用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)剖析，成果用均數(shù)±尺度差( ±s)表現(xiàn)，以t檢驗進行數(shù)據(jù)剖析，P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

　　2結(jié)果

　　2.1 顛倒相差顯微鏡所見的細胞形態(tài)的變更

　　用間斷負壓誘導的細胞增殖速度略低于正常培養(yǎng)組細胞，細胞形態(tài)逐漸由梭型向多角型轉(zhuǎn)化，帶有數(shù)個崛起，數(shù)目和形態(tài)不定，10-14 d細胞融會成單層，2周后逐漸形成多個散在的致密島狀構(gòu)造，而正常培養(yǎng)組細胞的形態(tài)大部分為梭型。誘導成功后，細胞1周左右傳1代，可穩(wěn)固傳10代。

　　2.2 ALP活性的測定

　　誘導2周后，間斷負壓誘導組的細胞ALP活性為(15.68±1.97)u/g，正常培養(yǎng)組為(6.34±1.21)u/g，t檢驗兩組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

　　2.3 茜素紅染色和Ⅰ型膠原及骨保護素的免疫組織化學檢測

　　負壓誘導2周后，茜素紅染色可見多個散在散布大小形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié)(圖1A)。Ⅰ型膠原免疫組織化學染色負壓組細胞胞漿中呈現(xiàn)大批黃褐色顆粒，陽性反映(圖1B)，正常培養(yǎng)組陰性反響;骨保護素免疫組織化學染色顯示表達程度明顯進步(圖1C)。

　　3討論

　　MSCs是骨髓中除造血干細胞以外的另一種干細胞，其起源穩(wěn)固、分別培養(yǎng)相對簡略及具有多向分化的才能，因而成為近年來研究的熱門。同源MSCs不產(chǎn)生免疫排擠反映，取材便利，是組織工程骨種子細胞的良好選擇。由于MSCs是骨修復(fù)進程中成骨祖細胞的重要起源，作者為了揭示負壓誘導對骨折、骨不連及骨壞逝世有何作用，首先從細胞角度研究負壓誘導對人MSCs分化的影響。本試驗立足于國內(nèi)外學者對于負壓封閉引流技術(shù)的實驗研究及臨床利用的基本之上，實驗進程中將含少量培育液的MSCs培養(yǎng)板放在無菌密閉負壓容器之中時，容器內(nèi)的負壓使細胞表面受到牽張應(yīng)力的同時，也導致細胞缺氧。作者斟酌高強度負壓條件下會導致MSCs細胞凋亡急劇增添，所以采取低強度間斷負壓進行誘導造就。

　　作者以為負壓誘導對MSCs分化的影響重要是通過機械刺激和細胞缺氧兩種機制共同作用的結(jié)果，激活細胞內(nèi)信號傳遞通道。實驗過程中細胞表面受到牽張應(yīng)力的機械刺激。機械刺激是細胞在生物進化過程中受到的Zui基礎(chǔ)刺激之一，恰當?shù)牧W刺激可促進其生長分化。生物機械刺激是影響骨組織形成和分化的重要外源性因素，力學信號傳遞至細胞內(nèi)從而啟動和調(diào)節(jié)相干基因蛋白的表達散布支架。Aaron等相差顯微鏡對MSCs間斷施加機械刺激表明可以促進細胞外基質(zhì)的合成和骨成熟，Wiesmann等支架利用牽張應(yīng)力作用于MSCs 3周發(fā)明Ⅰ型膠原和骨銜接素表達加強，細胞有顯明礦化結(jié)節(jié)形成，Simmons等測量顯微鏡應(yīng)用牽張應(yīng)力與成骨性誘導劑復(fù)合干涉MSCs，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)礦化是對比組的2.3倍。細胞的基質(zhì)礦化和成骨性分化是通過ERK1/2信號介導。我們發(fā)現(xiàn)低強度間斷負壓可以使MSCsⅠ型膠原表達加強，進而增進了細胞的成骨分化;負壓誘導過程中，細胞在受到牽張應(yīng)力作用的同時還合并缺氧。Lennon等支架研究發(fā)明，低氧條件下培養(yǎng)大鼠MSCs能增長其骨形成才能。HIF-1是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在機體的生理和病理過程中起要害性作用。低氧引起骨系細胞的功效變更主要通過HIF-1α來介導。HIF-1α及其下游基因VEGF表達增添，從而改良骨組織血供代償?shù)脱鯛顩r測量顯微鏡。Towler等支架以為在骨組織發(fā)育和塑型改建過程中HIF-1α具有促進成骨細胞發(fā)育和分化的作用，晉升HIF-1α介導可以加速細胞的成骨作用促進骨折修復(fù)。負壓誘導中HIF-1α和Ⅰ型膠原兩者之間應(yīng)當有協(xié)同關(guān)系。Ⅰ型膠原的表達一方面與應(yīng)力刺激有關(guān)，另一方面可能通過HIF-1α來介導，這有待進一步的研究。實驗檢測指標ALP是細胞向成骨細胞分化的主要標記酶，是成骨細胞早期和中期分化的主要標記，也是評價機體成骨活性和組織分化才能的特異性指標。ALP的活性高下與成骨細胞分化呈正相干關(guān)系。本實驗結(jié)果顯示經(jīng)間斷負壓誘導后MSCs的ALP活性比正常培養(yǎng)組明顯進步，具有統(tǒng)計學意義;成骨細胞在鈣化條件下培養(yǎng)具有體外礦化這一特色，也是成骨細胞的一種標記。本實驗通過茜素紅染色，發(fā)明負壓誘導2周后可見多個散在散布大小形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié)。楊林等[9]發(fā)現(xiàn)人MSCs向成骨細胞分化過程中骨保護素的表達逐漸進步。本研究結(jié)果顯示間斷負壓誘導可以促進MSCs對骨保護素的高表達，與其結(jié)論一致。綜上所述，本實驗通過間斷負壓誘導后的細胞為成骨細胞，進一步證實分離培養(yǎng)的細胞為成骨細胞的前體細胞MSCs。但是，本實驗方式中機械刺激的生物信號和HIF-1α調(diào)控兩者結(jié)合作用的分子生物學機制尚須進一步的研究。

　　我們通過間斷負壓勝利的誘導體外培育的人MSCs向成骨細胞分化，細胞可以穩(wěn)固傳代。一方面闡明人MSCs經(jīng)體外間斷負壓造就擴增后可以得到相當數(shù)目的成骨細胞，種植于具有良好生物相容性和可塑性的細胞構(gòu)造上，將為組織工程學修復(fù)骨或軟骨缺損供給更遼闊的起源;另一方面為我們進行負壓誘導對骨折、骨不連及骨壞死影響的試驗研究打下了良好的基本，為其盡早的服務(wù)于骨科臨床供給根據(jù)。

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　　支架Lennon DP, Edmison JM, Caplan AI. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension:effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis [J]. J Cell Physiol, 2001, 187(3):345-355.

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　　支架Towler DA. Vascular biology and bone formation:hints from HIF [J]. J Clin Invest, 2007, 117(6):1477-1480.

　　[9]楊林，海涌，曲鐵兵，等. 骨保護素和骨掩護素配體在人骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化進程中的表達 [J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2007, 13(5):339-341.


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