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　　如何選擇二抗作者:admin | 起源:qwbio | 更新時光:2009/11/3 通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到Zui適合該實驗的二抗，須要綜合以下幾個方面進行斟酌：

　　1 一抗的物種來源

　　一抗是在什么物種來源的，相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內(nèi)制備的，那么你就應該選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內(nèi)制備的，那么二抗就應當是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質(zhì)量并無顯明的影響。

　　2 一抗是屬于哪個類或亞類

　　二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體.

　　單克隆抗體的種別及亞類通常會在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應該是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

　　假如單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之聯(lián)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，假如你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標志實驗中尤其合適。

　　如果你不知道一抗是哪一類別或亞類，那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇，因為此種抗體可以識別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。

　　下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：

　　針對整個抗體分子（H＋L）具有特異性：如anti-IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的 Fc，F(xiàn)(ab’)2/Fab部分（見圖5）均可反應，anti-IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應（如IgM和IgA），因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈（?鏈或?鏈）。

　　針對Fab片段具有特異性：這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應，它們同時也已和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應。

　　這對Fc片段或重鏈具有特異性：這類抗體和重鏈的Fc部分反應，一次它們是類別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應，mu鏈特異性抗體只識別IgM，依此類推）。

　　輕鏈（lambda，kappa）特異性：與所有類別的抗體反響，因為所有類別的抗體均具有雷同的lambda鏈或kappa鏈。

　　經(jīng)過吸附處理的二抗：不同來源的免疫球蛋白含有類似的構(gòu)造，抗一個物種的抗體可能與其他物種產(chǎn)生交叉反應，一次有些二抗經(jīng)過了動物或人類IgG吸附處置，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處置過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識別表位的數(shù)目被大大減少。

　　3 選擇哪種情勢的二抗，是全部IgG分子，F(xiàn)(ab’)2片段，還是Fab片斷？

　　全部IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

　　F(ab’)2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵銜接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結(jié)合的情況。

　　Fab片段：它們只有一個結(jié)合位點，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

　　4 選用耦聯(lián)有哪種探針的二抗？

　　一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針重要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，Zui常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以應用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大水平的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測體系。

　　下面簡略先容幾種二抗探針的優(yōu)缺陷及其實用的實驗：

　　酶：

　　重要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比擬而言，前者更經(jīng)濟、快速、穩(wěn)固，而后者較前者更為敏銳，通常情形下，HRP普遍利用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更合適于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.

　　熒光基團：

　　FITC：FITC是普遍使用的熒光基團，但其Zui大的毛病是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。

　　AMCA：常用在多標記實驗中，如免疫熒光、流式細胞術(shù)。其缺陷是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測其所激發(fā)的藍色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更實用于檢測大批存在的抗原。

　　花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)固，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團更亮，更穩(wěn)固，背景更弱。二者常在共聚焦顯微試驗中作多標志。但Cy5的毛病是不能用表面熒光顯微鏡察看，因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡視察。

　　TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標記實驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會發(fā)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。

　　PE：常和FITC一起用于流式細胞術(shù)雙標記實驗。

　　生物素：

　　生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）產(chǎn)生不可逆反應而緊密結(jié)合在一起。首先加進生物素標記的二抗，在參加耦聯(lián)有酶或熒光團體的 avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。

　　5 抗體的純度：

　　親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因為這些產(chǎn)品的純度Zui高，產(chǎn)生的非特異性背景Zui少。但是有些情況下也要考慮到純化進程中喪失的IgG部分，因為其中含有親和力很高的抗體，尤其是當目標抗原存在的量很小的時候，高親和性的IgG部分就顯得尤為主要

　　

　　通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到Zui合適該實驗的二抗，須要綜合以下幾個方面進行斟酌：

　　1 一抗的物種起源

　　一抗是在什么物種來源的，相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內(nèi)制備的，那么你就應當選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內(nèi)制備的，那么二抗就應當是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質(zhì)量并無顯明的影響。

　　2 一抗是屬于哪個類或亞類

　　二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體.

　　單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應該是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

　　如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。

　　假如你不知道一抗是哪一種別或亞類，那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇，由于此種抗體可以辨認大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。

　　下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：

　　針對整個抗體分子（H＋L）具有特異性：如anti-IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的 Fc，F(xiàn)(ab’)2/Fab部分（見圖5）均可反應，anti-IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應（如IgM和IgA），因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈（?鏈或?鏈）。

　　針對Fab片段具有特異性：這類抗體與重鏈輕鏈均可以聯(lián)合，由于它們可以與輕鏈反響，它們同時也已和具有雷同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反映。

　　這對Fc片斷或重鏈具有特異性：這類抗體和重鏈的Fc部分反映，一次它們是種別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反響，mu鏈特異性抗體只辨認IgM，依此類推）。

　　輕鏈（lambda，kappa）特異性：與所有類別的抗體反映，因為所有類別的抗體均具有雷同的lambda鏈或kappa鏈。

　　經(jīng)過吸附處置的二抗：不同起源的免疫球蛋白含有類似的構(gòu)造，抗一個物種的抗體可能與其他物種產(chǎn)生交叉反應，一次有些二抗經(jīng)過了動物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體辨認表位的數(shù)目被大大減少。

　　3 選擇哪種情勢的二抗，是整個IgG分子，F(xiàn)(ab’)2片段，還是Fab片段？

　　全部IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

　　F(ab’)2片斷：該種抗體是由兩個靠二硫鍵銜接的用于聯(lián)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情形中，如須要避免抗體與具有Fc受體的細胞結(jié)合的情況。

　　Fab片段：它們只有一個結(jié)合位點，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

　　4 選用耦聯(lián)有哪種探針的二抗？

　　一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗重要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，Zui常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，數(shù)碼顯微鏡，組織免疫化學，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大水平的放大檢測信號，可以應用biotin/avidin檢測體系。

　　下面簡略先容幾種二抗探針的優(yōu)毛病及其實用的試驗：

　　酶：

　　主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比擬而言，前者更經(jīng)濟、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為敏銳，通常情況下，HRP普遍利用于免疫組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.

　　熒光基團：

　　FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團，但其Zui大的缺點是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。

　　AMCA：常用在多標記實驗中，如免疫熒光、流式細胞術(shù)。其缺點是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測其所激發(fā)的藍色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大批存在的抗原。

　　花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺陷是不能用表面熒光顯微鏡視察，因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡察看。

　　TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標志試驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會發(fā)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起應用，由于RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。

　　PE：常和FITC一起用于流式細胞術(shù)雙標記實驗。

　　生物素：

　　生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）發(fā)生不可逆反應而緊密結(jié)合在一起。首先加進生物素標記的二抗，在參加耦聯(lián)有酶或熒光團體的 avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。

　　5 抗體的純度：

　　親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因為這些產(chǎn)品的純度Zui高，發(fā)生的非特異性背景Zui少。但是有些情形下也要斟酌到純化進程中喪失的IgG部分，由于其中含有親和力很高的抗體，尤其是當目標抗原存在的量很小的時候，高親和性的IgG部分就顯得尤為主要


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