顯微鏡,顯微鏡價格,顯微鏡的價格

　　 【摘要】 目標(biāo) 探討聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及其機制。方法 將人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP分為A、B、C、D 4組（分辨為對照組、單純順鉑組、血卟啉+超聲組、順鉑+血卟啉+超聲組）,視察各組處理后癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞克隆形成情形,聯(lián)合用藥后果及bcl2和bax表達(dá)的變更。結(jié)果 D組COC1/DDP細(xì)胞增殖抑制明顯,細(xì)胞凋亡率升高,均與其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,bcl2蛋白陽性表達(dá)率在C、D組顯著降


　　低(P<0.05),A、B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。bax蛋白陽性表達(dá)率在各組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 聲動力療法聯(lián)合順鉑能有效地加強對耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷才能,減少癌細(xì)胞的天生。

　　【癥結(jié)詞】 卵巢癌; 聲動力療法; 血卟啉; 順鉑

　　A Discussion on Effect and Mechanism of Haematoporphyrin to Chemotherapy Sensitivity of Cisplatin on COC1/DDP

　　ZHOU Xiaoli1,TANG Liangdan2,WANG Yan1,PENG Liqin1

　　(1.Department of Gynecology,Maternal and Child Health Hospital of Leshan City,Sichuan Leshan 614000,China;2.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

　　【Abstract】 Objective To determine whether sonodynamic treatment (SDT) can enhance chemotherapy effect of cisplatin on ovarian cancer cells. Methods Drug resistance ovarian cancer cells COC1/DDP were divided into 4 groups randomly:cisplatin (DDP)group,haematoporphyrin(Hp)+ Ultrasound group，奧林巴斯,cisplatin(DDP)+ haematoporphyrin(Hp)+Ultrasound group and control group.Cell proliferation,apoptosis,protein bcl2 and bax expression were observed.Results In DDP+ Hp+Ultrasound group,cell proliferation was greatly inhibited,COC1/DDP cell clone efficiency was the lowest(P<0.05).Bcl2 expression in Hp+ Ultrasound group and DDP+Hp+ Ultrasound group deceased significantly (P<0.05),while there were no obvious difference in control goup and cisplatin group.We did not observe great difference in protein bax expression in any group (P>0.05). Conlusion SDT could effectively enhance cell killing ability of cisplatin on drug resistance ovarian cancaer cells.

　　【Key words】 ovarian caner; sonodynamic treatment; haematoporphyrin; cisplatin

　　卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖體系Zui常見的惡性腫瘤之一,也是婦科腫瘤中預(yù)后Zui差的癌癥,除了難以早期發(fā)明外,化療耐藥是卵巢癌治療失敗的重要原因之一。鉑類藥物為主的聯(lián)合化療是目前卵巢癌的一線化療計劃,患者5年生存率一直彷徨在30 %左右?；熌退幍陌l(fā)生被以為是引起生存率降低的重要原因之一,嚴(yán)重影響了卵巢癌患者的化療療效和生存質(zhì)量?；熌退幨嵌嘁蛩?、多道路共同作用的成果,抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡受阻是其主要機制之一。因此,尋找一種新興治療理念逆轉(zhuǎn)耐藥或者直接滅活耐藥卵巢癌細(xì)胞是醫(yī)學(xué)工作者亟待解決的要害問題,更是腫瘤康復(fù)中進步女性生產(chǎn)率和改良女性生涯質(zhì)量的急切須要。聲動力療法（SDT）是一種很有利用遠(yuǎn)景的治療腫瘤的辦法。大批研究表明,超聲加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比單獨超聲對腫瘤細(xì)胞更具有殺傷后果,血卟啉則無抗腫瘤效應(yīng)［1,2］。有報道說這種殺傷作用機制是通過引誘細(xì)胞凋亡［3］。在本實驗中,作者把超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用于人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞,察看其殺傷的作用,以期降低卵巢癌對順鉑化療的耐藥。

　　1 資料、儀器與方式

　　1.1 資料

　　1.1.1 試劑和儀器 超聲增敏劑血卟啉購自Sigma公司,注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字H37021358）,四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、姆薩色素為Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理鹽水配成5 mg/ml的溶液,過濾除菌后4 ℃避光保留。超聲裝置為陜西師范大學(xué)聲學(xué)研究所研制,探頭面積為4.7 cm2.

　　1.1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞株為人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP（購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。COC1/DDP在含有0.5 μg/ml順鉑的完全培養(yǎng)基（50 μg/ml青霉素,50 μg/ml鏈霉素和10 %胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基）37 ℃,5 % CO2慣例細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。實驗前1周換用不含順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

　　1.2 方式

　　1.2.1 MTT法檢測各實驗組對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響 把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔0.2×104個接種于96孔板中,每孔200 μl完整造就基。12 h落后行試驗干涉,按以下分組進行實驗干涉,A組(對照組):單純造就COC1/DDP細(xì)胞;B組(單純順鉑組):在細(xì)胞中加進順鉑,順鉑選0.625、1.25、2.5、5 μg／ml 4個濃度;C組(血卟啉+超聲組):血卟啉選0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml 4個濃度,同時進行超聲照耀60 s;D組(順鉑+血卟啉+超聲組):細(xì)胞液中參加順鉑和血卟啉,使其終濃度分辨為0.625、1.25、2.5、5 μg／ml和0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml,同時進行超聲照耀60 s.每組設(shè)5個復(fù)孔,此時記為0 d;于37℃、5 % CO2的飽和濕度箱中持續(xù)培育和察看,于3 d后取出 96孔板,1 200 r/min離心10 min.往上清,參加180 μl完整造就基和20 μl MTT,37 ℃持續(xù)培育4 h,離心后警惕吸棄上清。再加進150 μl DMSO,振蕩10 min,充足溶解。選擇490 nm,在酶標(biāo)儀測定各孔吸光率。實驗反復(fù)3次。按下列公式求出增殖抑制率:腫瘤細(xì)胞增殖克制率=［1(藥物處置組OD值空白對比組OD值)／(細(xì)胞對照組OD值空缺對照組OD值)］×100 ％.

　　1.2.2 PI/Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情形 細(xì)胞生長達(dá)80 %融會時消化傳代,以每孔0.3×104個接種于96孔板中,每孔200 μl完整培育基。12 h落后行實驗干涉,分組同前,72 h后,每孔依次參加細(xì)胞染色緩沖液100 μl、Hoechst染色液0.5 μl、PI染色液0.5 μl冰浴30 min,PBS洗滌1次,再在熒光顯微鏡下察看。計數(shù)凋亡細(xì)胞比例。

　　1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實驗干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變更 選取對數(shù)生長期的COC1/DDP細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,按2×104/ml接種于24孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)12 h后按前述辦法進行分組處置。各組細(xì)胞經(jīng)實驗處置后置于37 ℃,5 % CO2孵箱中持續(xù)培養(yǎng)8 h,收集細(xì)胞,涂布細(xì)胞于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,室溫風(fēng)干,純丙酮室溫固定30 min.按免疫組化試劑盒應(yīng)用闡明書分辨進行:純甲醇加過氧化氫至0.5 %,室溫30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗滌后，滴加免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗體,置濕盒中37℃,20 min,0.01 N PBS洗2 min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置濕盒中37℃,20 min.0.01 N PBS洗2 min×3次后滴加SABC 37 ℃,20 min,0.01 N PBS洗5 min×4次后，DAB顯色10 min,蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下視察細(xì)胞漿著色呈棕黃色的為陽性細(xì)胞,每張片隨機計數(shù)3個視野,每樣品取5張片的均勻值為陽性表達(dá)率。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方式

　　所獲實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±尺度差(±s)表現(xiàn),采取SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差剖析,進行單因素方差剖析和明顯性檢驗。預(yù)先用Homogeneity of Variances進行方差齊性檢驗,如方差齊采取LSD檢驗,如方差不齊采取TamhaaeT2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 MTT法檢測各試驗組對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響

　　順鉑、血卟啉、順鉑和血卟啉聯(lián)用對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響（見表1、2）,兩種辦法聯(lián)用的增殖抑制率隨著各自濃度的增長而增添,各組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表1 順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的細(xì)胞增殖MTT實驗OD值表2 順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的增殖抑制率

　　2.2 順鉑和血卟啉聯(lián)合利用對COC1/DDP細(xì)胞凋亡的影響

　　順鉑組和血卟啉組的凋亡率高于空缺對比組,其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);血卟啉＋順鉑組與血卟啉組和順鉑組相比,其凋亡率高于血卟啉組溫柔鉑組,其差異均有明顯性(P<0.05)。提醒血卟啉溫柔鉑都對COC1/DDP細(xì)胞有增進凋亡的作用,而且血卟啉和順鉑聯(lián)用能夠增強這種促進作用(見表3、圖1)。表3 順鉑和血卟啉結(jié)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的凋亡率

　　2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實驗干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變更

　　bcl2免疫組化染色光學(xué)顯微鏡下視察到空缺對照組和順鉑組中可見很多細(xì)胞內(nèi)胞漿呈棕黃色,高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有大批棕黃色顆粒,而血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組此種細(xì)胞顯明減少。Bax蛋白的免疫組化染色可見在血卟啉+超聲組溫柔鉑+血卟啉+超聲組中有較多的胞漿呈棕黃色顆粒的細(xì)胞,而對照組和順鉑中的此種細(xì)胞較少,bcl2蛋白及bax表達(dá)陽性率（見表4）。統(tǒng)計剖析結(jié)果表明:血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組的bcl2蛋白陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05),而空白對照組和順鉑組的細(xì)胞內(nèi)bcl2蛋白陽性表達(dá)率差異無顯著性(P>0.05)。bax蛋白陽性表達(dá)率在各組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4、圖2)。表4 順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的bcl2蛋白及bax表達(dá)陽性率

　　3 討論

　　聲動力療法（SDT）是指對腫瘤患者靜脈注射聲敏劑,而后用必定頻率和強度超聲輻射腫瘤部位,使湊集在腫瘤部位聲敏劑發(fā)生抗腫瘤因子而殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤的生長。有學(xué)者以為由于超聲產(chǎn)生空化作用,其成果是起源于聲敏劑的自由基,再與氧分子反響天生過氧基和烷氧基,過氧基和烷氧基與溶液中的有機分子反映活性低,更易于達(dá)到靶細(xì)胞的表面,損壞癌細(xì)胞的脂質(zhì)和細(xì)胞膜,導(dǎo)致膜通透性加強而損傷細(xì)胞,此外,過氧基和烷氧基還可以導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,染色體變異等損壞細(xì)胞。目前認(rèn)為較好的聲敏劑還是卟啉類為主［4］,因此本實驗選擇血卟啉做聲敏劑能對超聲有良好的敏感性,發(fā)生大批活性氧對細(xì)胞進行殺傷作用。

　　本實驗發(fā)明,COC1／DDP細(xì)胞對順鉑顯著耐藥,血清峰值濃度(2.5 g／ml)以下的順鉑對COC1／DDP細(xì)胞增殖未見明顯影響,這與文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)一致［5］。但與血卟啉合用時,血清峰值濃度以下的順鉑明顯抑制了COC1／DDP細(xì)胞增殖。提示超聲激活的血卟啉能夠提高耐藥的卵巢癌細(xì)胞COC1／DDP對順鉑的敏感性,從而增長順鉑對該細(xì)胞的殺傷作用。干擾細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡是順鉑治療腫瘤的主要門路,而血清峰值濃度的順鉑對COC1／DDP的凋亡率幾乎無影響,但與血卟啉合用時,可致細(xì)胞凋亡率顯著升高，這提醒超聲激活的血卟啉進步耐藥細(xì)胞株COC1／DDP對順鉑敏感性的機制可能是恢復(fù)了耐藥細(xì)胞株的凋亡道路,從而恢復(fù)了順鉑治療腫瘤的作用。

　　細(xì)胞凋亡是在基因把持下的細(xì)胞自身滅亡進程,涉及一系列的基因表達(dá)的級聯(lián)反映,受凋亡克制基因（bc12/bax）和凋亡增進基因的調(diào)控。順鉑可以引誘細(xì)胞凋亡,但耐藥卵巢癌細(xì)胞中bc12/bax顯明增高,這是導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的主要原因之一。因此,抗腫瘤治療中,有效地下降bc12/bax含量是取得療效的要害之一。

　　已有研討發(fā)明,進步細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生率顯明增添,以為細(xì)胞內(nèi)的ROS作為一種信使分子在調(diào)控細(xì)胞生存及凋亡進程中起要害作用［6,7］。1988年,Vaux等［8］ 首先證實bcl2基因高表達(dá)可顯著延伸細(xì)胞的生存周期。體外研討亦表明bcl2可禁止很多刺激物誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,且bcl2的克制可能是細(xì)胞凋亡的共同通道［9］。 bax是bcl2家族的另一成員,與bcI2形成異二聚體,也對細(xì)胞凋亡進行調(diào)控［10］。在體內(nèi),bcl2與bax相互影響,相互拮抗,其作用并不直接表示為單獨的bcl2和bax對凋亡的影響,而是由bcl2／bax來決議細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。研究顯示，bc12／bax比值下降,可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,作為細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控的重要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在調(diào)亡的調(diào)節(jié)中起癥結(jié)作用。本試驗的 bcl2蛋白及bax蛋白免疫細(xì)化染色成果顯示，超聲激活的血卟啉結(jié)合順鉑作用人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP，bcl2蛋白程度明顯低于對比組(P<0.05);而順鉑組和對照組比擬,bcl2蛋白陽性表達(dá)率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。闡明超聲激活的血卟啉結(jié)合順鉑作用可以下降人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表達(dá)程度,bax蛋白表達(dá)水平在實驗組及對照組差別均無統(tǒng)計學(xué)意義,提醒聲動力作用是通過下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2／bax的比值降落來增進人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP產(chǎn)生凋亡。

　　聲動力療法（SDT）是繼手術(shù)、放療、化療后新興的一種腫瘤治療手腕,具有無創(chuàng)、細(xì)胞毒性低、選擇性殺傷等長處。本實驗僅初步研究了超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑對耐藥的卵巢癌細(xì)胞的作用,還須要進一步增添超聲的劑量,將血卟啉的濃度范疇擴展,找出三者協(xié)同作用的Zui佳比例,為以后利用于臨床供給理論基本。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　［1］ 馬玉英.聲化學(xué)激活血卟啉對S180腫瘤作用的研究［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報,1995,14(4):374.

　?。?］ 束存牛,馬玉英,齊浩.超聲激活血卟啉對K562 腫瘤作用的研討［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1998,26(2):33.

　?。?］ 劉全宏,孫世惠,宵婭萍.超聲激活血卟啉對S180細(xì)胞殺傷作用及形態(tài)學(xué)研究［J］. 中國科學(xué)(C 輯),2002,32 (5):454.

　?。?］ Takimoto CH,Glover K,Huang X,et al.Phase l Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Unconjugatedsoy Isoflavones Administered to Individuals with Cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prey,2003,12:1 213.

　?。?］ GAO Fei,YI Jing,SHI Guiying,et al.The Susceptibility of Leukemia Cells to Arsenic Trioxideinduced Apoptosis Is Determined by Cellular Reactive Oxygen Species Level［J］.Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2001,33(5):585.

　　［6］ 高飛,易靜,史桂英,等.活性氧程度決議白血病細(xì)胞對三氧化二砷引誘細(xì)胞凋亡的敏感性［J］.生物物理學(xué)報,2001,33(5):585.

　?。?］ Reed J C.Bcl2 and the Regulation of Progrnmmed Cell Death［J］.Cell Biol,1994,124(2):1.

　?。?］ Vaux D L,Cory S,Adams J M.Bcl2 Gene Promote Sheamopoietic Cell Survival and Cooperates with cmyc to Immortalize preB Cells［J］.Nature,1998,35(2)：345.

　　［9］ Oltvai Z N,Milliman C L,Korsmeyer S J.bcl2 Heterodimerizes in vivo with a Conserved Homolog Bax,that Accelerates Programmed Cell Death［J］.Cell,1993,74(4):609.

　?。?0］ Chrestsa C M,Masters J R W,Hicleman J A.Hypensensitivity of Human Testiculartiumors to Etoposideinduced Apotosis Is Associated with Functional p53 and High bax:bcl2 Ration［J］.Cancer Res,1996,569(2):1 834.