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　　一、目標請求

　　1、學(xué)習(xí)控制細菌制片的操作技巧和無菌操作技巧。

　　2、學(xué)習(xí)控制細菌芽孢、鞭毛、莢膜的染色辦法。

　　二、試驗原理

　　細菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一項基礎(chǔ)技巧。細菌的細胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易辨認，必須對它們進行染色。應(yīng)用單一染料對細菌進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成顯明的色差，從而能更明白地觀察到其形態(tài)和構(gòu)造。

　　染色前必需固定細菌。其目標有二：一是殺逝世細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增添其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種辦法。固定時盡量保持細胞原有的形態(tài)。

　　1. 鞭毛是細菌的活動“器官，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛者生的位里和數(shù)目是細茵的一項主要形態(tài)特點。細菌的椒毛很纖細，其直徑通常為0 . 01～0.02 um ，所以，除了很少數(shù)能形成毛束（由很多根鞭毛構(gòu)成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，一般細菌的鞭毛均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學(xué)顯微鏡觀寮細菌的鞭毛，必需用鞭毛染色法。

　　鞭毛染色的基礎(chǔ)原理，是在染色前先用媒染劑處置，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。鞭毛染色方式很多，本試驗先容鞭毛染色法和改進的Uifson 氏染色法，前一種辦法更輕易控制，但染色劑配制后保留期較短。

　　2.細菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，顯微鏡報價配件，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽孢呈無色透明狀）。芽孢染色法就是依據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特色而設(shè)計的。所有的芽孢染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還須要加熱，以增進芽孢著色。當(dāng)染芽孢時，菌體也會著色，然后水洗，芽孢染上的色彩難以滲出，而菌領(lǐng)會脫色。然后用對照度強的染料對菌體復(fù)染，使菌體和芽孢浮現(xiàn)出不同的色彩，因而能更顯明地烘托出芽胞，便于視察。

　　3. 莢膜是包抄在細菌細胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物資，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易染色；而且可溶于水，易在用水沖刷時被除往。所以通常用烘托染色法染色（負染色法），使菌休和背景著色，而莢膜不著色，在菌體四周形成一透明圈。由于莢膜含水高，制片時通常不用熱固定，以免變形影響察看。

　　三、實驗器材

　　1、菌種：蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）斜面菌種。

　　2、顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、載玻片、蓋玻片、試管、細玻棒、水浴鍋。

　　3、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、鞭毛染色液、0.5％沙黃水溶液、繪圖墨水、95％乙醇、石炭酸復(fù)紅染液、5%孔雀綠溶液、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙料瓶（香柏油和二甲苯）。

　　四、方法步驟

　　1. 細菌鞭毛染色步驟：

　?。╨）菌種的籌備請求用活潑生長期菌種作鞭毛染色和活動性的觀察。對于冰箱保留的菌種，通常要持續(xù)移種1－2 次，然后可選用下列方式接種造就作染色用菌種：a取新配制的養(yǎng)分瓊脂斜面（表面較濕潤、基部有冷凝水）接種，28 ～ 32 ℃ 培育10～14h ，取斜面和冷凝水交接處培養(yǎng)物作染色觀察資料；b選取新制備的養(yǎng)分瓊脂（含0.8～1 . 0 ％的瓊脂）平板，用接種環(huán)將新穎菌種．點種于平板中心，28～32 ℃ 造就18 ～30h ，讓菌種擴散生長，取菌落邊沿的菌苔（不要取菌落中心的菌谷）作染色視察的菌種資料。

　?。?）載玻片的籌備將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮沸約20 min ，取出用凈水充足洗凈，瀝干水后置95％乙醇中，用時取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。

　　（3）菌液的制備。取斜面或平板菌種培育物數(shù)環(huán)于盛有1－2 環(huán)無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片, 也可用培育物直接制片，但后果往往不如先制備菌液。挑菌時，盡可能不帶造就基。

　?。?）制片取一滴菌液于載玻片的一端，然后將玻片傾斜，便菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸往玻片下端過剩菌液，室溫｛或37 ℃ 溫室）自然千燥。干后應(yīng)盡快染色不宜放，時光過長。

　?。?）染色涂片干燥后，滴加鞭毛染色A 液頂蓋3~5 min ，用熏餾水充分洗去A 液．用B 液沖去殘水后，再加B 液夜蓋涂片染色約數(shù)秒至l min ，當(dāng)涂面呈現(xiàn)顯明褐色時，立即用蒸餾水沖洗，若加B 液后顯色較慢，可用微火加熱，直至顯褐色時立即水洗，自然干燥。

　?。?）鏡檢干后用油鏡觀察。觀察時，可從玻片的一端逐漸移至另一端，有時只在涂片的必定部位觀察到鞭毛．

　　菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色、通常呈波浪形。

　　2. 細菌芽孢染色步驟：

　　A.改進的Schaeffer-Fulton氏染色法

　　（l）制備菌懸液：加1-2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2-3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。

　?。?）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2-3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充足混雜。

　?。?）加熱：將此試管浸于沸水浴的燒杯中，加熱15-20min。

　　（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于干凈的載玻片上，做成涂面，晾干。

　?。?）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次固定。

　?。?）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠色彩為止。

　　（7）復(fù)染：加番紅染液染色2-3min后，傾往染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。

　　（8）鏡檢：先低倍，再高倍，Zui后用油鏡觀察。

　　成果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。

　　B.Schaeffer-Fulton氏染色法

　　（l）涂片：按慣例方式將待檢細菌制成涂片。

　　（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2-3次固定。

　?。?）染色：加數(shù)滴5%孔雀綠染液于涂片處，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染液冒蒸汽并開端盤算時光，保持5min。加熱進程中要隨時添加染色液，切勿讓標本干枯。待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖刷，直至流出的水無色為止。用番紅染液復(fù)染2min。

　?。?）水洗：用緩水流洗后，吸干。

　　（5）鏡檢：先低倍，再高倍，Zui后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。。

　　成果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。

　　3. 細菌莢膜染色步驟：

　　A. 干墨水法

　?。╨） 制混雜液:加一滴6％葡萄塘液于干凈載玻片的一端，然后挑取少量菌體與其很合，再加一環(huán)墨水，充足混勻．玻片必需干凈無油跡．否側(cè)，涂片時混雜液不能均勻散開

　?。?） 涂片:另取一端邊沿光滑的載玻片作推片，將推片一真?zhèn)€邊沿里于混合液前方，然后稍向后拉，當(dāng)推片與混合液接觸后，輕輕左右移動，使之沿推片接觸的后緣散開，爾后以大約300o角敏捷將混合液推向玻片另一端，使混合液展成薄層.

　?。?） 干燥:空氣中自然千燥．

　?。?） 固定:用甲醇浸沒涂片固定一分鐘．傾去甲醇．

　?。?） 干燥:在酒精燈上方用文火干燥．

　　（6） 染色:用甲基紫染1～2min

　?。?） 水洗:用自來水輕輕沖洗，自然干燥．

　?。?） 鏡檢:用低倍和高倍鏡察看．

　　背景灰色．菌體紫色，菌體四周的清楚透明圈為莢膜．

　　B. Anthony 氏法

　?。?）涂片:按慣例取菌涂片。

　　（2）固定:空氣中自然干燥。不可加熱干燥固定。

　?。?）染色:用l％的結(jié)晶紫水溶液染色2 min．

　?。?）脫色:以20％的硫酸銅水溶液沖刷．用吸水紙吸干殘液．

　?。?）鏡檢:干后用油鏡視察．

　　菌體染成深紫色，菌體四周的莢膜呈淡紫色。

　　試驗報告：

　　1． 繪出所用資料的芽胞、鞭毛、莢膜和菌體的形態(tài)圖。

　　2．闡明芽胞染色法的原理。用簡略染色法能否察看到細菌的芽孢？

　　3．用Schaeffer-Fulton氏染色法加熱染色時，若因一時忽視玻片上的染液被烘干，此時是否立即補加染液？為什么？

　　4．若涂片上所觀察到的只是大批游離芽孢，很少看到芽孢囊及養(yǎng)分細胞，你以為這是什么原因？


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