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　　 實驗四細菌、放線菌、霉菌和酵母菌的細胞形態(tài)與菌落形態(tài)觀察

　　一、試驗目標

　　1．觀察細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的代表種類的菌落形態(tài)特征。　　

　　2．放線菌、酵母菌和霉菌的細胞形態(tài)觀察。

　　二、實驗原理　　

　　菌落形態(tài)是指某種微生物在必定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在必定培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特征，應用觀察這些特點，來區(qū)分各大類微生物及初步辨認、鑒定微生物，方式簡便快速，在科研和生產(chǎn)實踐中常被采取。

　　三、實驗資料和用具

　　圓褐固氮菌，枯草芽孢桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉的單個菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；Bouin氏固定液，0．01％結晶紫溶液，酒精等。

　　顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)。

　　四、操作步驟

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　　觀察圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉的單個菌落特征，并按實驗菌落特征描寫的辦法記載成果。　　

　?。ǘ┓啪€菌的形態(tài)觀察

　　用鑷子警惕取出用插片法造就的放線菌培育皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在干凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡察看。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差別。

　　（三）霉菌的形態(tài)視察

　　1．粘片觀察：取一滴棉藍染色液置于載玻片中心，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。

　　2．假根觀察：將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種結構。

　?。ㄋ模┙湍妇男螒B(tài)觀察

　　酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定

　　1．以無菌水洗下PDA斜面造就的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。

　　2. 取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中心，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下視察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分逝世細胞(藍色)與活細胞(不著色)。

　　3. 在一個視野里計數(shù)逝世細胞和活細胞，共計數(shù)5～6個視野。

　　酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表現(xiàn)，以下式來盤算：

　　死亡率=死細胞總數(shù)／逝世活細胞總數(shù)×100%

　　五、注意事項

　　1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤；在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可進步子囊形成率；通過微加熱增添酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。

　　2．培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應特殊注意無菌操作，嚴防雜菌污染。

　　3．玻璃紙法培育接種時注意玻璃紙與平板瓊脂造就基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，

　　六、實驗報告

　　1. 將觀察到的微生物菌落特征填進下表中。

　　2. 計算酵母菌的死亡率

　　3．根霉和青霉形態(tài)圖，示各部。

　　七、問題和思考

　　1. 試比擬細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)的差別？

　　2．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何差別?

　　3．在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和睦生菌絲?

　　一、實驗目標

　　1．察看細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的代表種類的菌落形態(tài)特點?！　?

　　2．放線菌、酵母菌和霉菌的細胞形態(tài)觀察。

　　二、試驗原理　　

　　菌落形態(tài)是指某種微生物在必定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特征，應用觀察這些特點，來區(qū)分各大類微生物及初步辨認、鑒定微生物，方式簡便快速，在科研和生產(chǎn)實踐中常被采取。

　　三、實驗資料和用具

　　圓褐固氮菌，枯草芽孢桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉的單個菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；Bouin氏固定液，0．01％結晶紫溶液，酒精等。

　　顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)。

　　四、操作步驟

　?。ㄒ唬┧拇缶涞男螒B(tài)觀察

　　觀察圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉的單個菌落特征，并按實驗菌落特征描寫的方式記載成果?！　?

　　（二）放線菌的形態(tài)觀察

　　用鑷子警惕取出用插片法培養(yǎng)的放線菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在干凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差別。

　　（三）霉菌的形態(tài)觀察

　　1．粘片觀察：取一滴棉藍染色液置于載玻片中心，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。

　　2．假根視察：將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種結構。

　?。ㄋ模┙湍妇男螒B(tài)觀察

　　酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定

　　1．以無菌水洗下PDA斜面培育的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。

　　2. 取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。

　　3. 在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)5～6個視野。

　　酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表現(xiàn)，以下式來計算：

　　死亡率=死細胞總數(shù)／死活細胞總數(shù)×100%

　　五、注意事項

　　1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新穎、表面濕潤；在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可進步子囊形成率；通過微加熱增添酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。

　　2．培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應特殊注意無菌操作，嚴防雜菌污染。

　　3．玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，

　　一、實驗目的和內(nèi)容

　　目標：懂得自然存在的酵母菌及其形態(tài)構造。懂得酵母菌發(fā)生子囊孢子的條件及其形態(tài)。

　　內(nèi)容：

　　1．察看酵母菌個體形態(tài)。

　　2．觀察酵母菌的假菌絲和滋生進程。

　　3．觀察自然狀況的酵母菌。

　　二、試驗資料和用具

　　釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。

　　PDA培養(yǎng)基、麥氏(McCLary)培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基)、0.05%美藍染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸緩沖液配制)、碘液、0.04%的中性紅染色液%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇；

　　顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個三角形玻璃棒支架的培養(yǎng)皿。

　　三、操作步驟

　　(一)酵母菌形態(tài)觀察

　　1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定

　　(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。

　　(2)取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。

　　(3)在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)5～6個視野。

　　酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表現(xiàn)，以下式來計算：

　　死亡率=死細胞總數(shù)÷死活細胞總數(shù)×100%

　　2．酵母菌液泡系的話體觀察 于干凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混雜，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞無色，液泡呈紅色。

　　3．酵母菌細胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置于載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細胞內(nèi)的貯躲物資肝糖顆粒呈深紅色。

　　4．酵母菌子囊孢子的觀察

　　(1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新穎的麥芽汁培養(yǎng)基上，置28C培養(yǎng)2～3d，然后再移植2～3次。

　　(2)轉(zhuǎn)接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀酒酵母轉(zhuǎn)接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30℃恒溫培養(yǎng)14d。

　　(3)觀察：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，Zui后用0.5%沙黃液復染30S，水洗往染色液，Zui后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀察子囊孢子的數(shù)目、外形和子囊的形成率。

　　(4)盤算子囊形成的百分率：計數(shù)時隨機取3個視野，分辨計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細胞，然后按下列公式盤算：

　　子囊形成率（%）=3個視野中形成子囊的總數(shù)

　　÷3個視野中（形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細胞總數(shù)）×100%

　　5．酵母菌假菌絲的觀察 取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在溫室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1)，28℃培養(yǎng)2～3d后，取出載玻片，擦往載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察?？梢姷窖恐辰湍感纬傻呐汗?jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2)。

　　6．自然狀況下的酵母菌觀察 取一滴美藍染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下細心觀察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。

　　四、注意事項

　　1．用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新穎、表面濕潤。

　　2．在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可進步子囊形成率。

　　3．通過微加熱增添酵母的死亡率，易于觀察死亡細胞。

　　五、實驗報告

　　(一)繪圖

　　1．數(shù)個酵母菌細胞，示觀察到的構造。

　　2．數(shù)個子囊及子囊孢子形態(tài)圖。

　　(二)記載并計數(shù)酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記載及計算成果)。

　　六、問題和思考

　　1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何差別?

　　2．如何差別養(yǎng)分細胞和開釋出的子囊孢子?

　　3．試設計一個從子囊中分別子囊孢子的實驗計劃。

　　注：

　　酵母菌的簡易培養(yǎng) 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝進三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl調(diào)至pH3～5放進幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，聞到酒香味后，即可取培養(yǎng)液鏡檢


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