顯微鏡,顯微鏡價(jià)格,顯微鏡的價(jià)格

　　【摘要】 【目標(biāo)】 研究經(jīng)Triton X-100 脫細(xì)胞處理的牛頸靜脈的組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性以及作為組織工程血管支架的可能性?！痉椒ā?獲取10條新鮮帶瓣牛頸靜脈，隨機(jī)分為兩組，新鮮對比組(n = 5)和脫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(n = 5)，脫細(xì)胞組血管使用2.5 mL/L Triton X-100等進(jìn)行脫細(xì)胞處理48 h， 病理切片染色和掃描電鏡觀察血管壁和瓣膜自身細(xì)胞的脫除情況和細(xì)胞外基質(zhì)變化情況;生物力學(xué)性能檢測血管組織強(qiáng)度變化;體外人內(nèi)皮種子細(xì)胞種植以懂得脫細(xì)胞支架的生物相容性?！窘Y(jié)果】 脫細(xì)胞處理后，管壁和瓣膜的自身細(xì)胞完全脫除而彈力纖維和膠原纖維無明顯改變;與新鮮牛頸靜脈相比，脫細(xì)胞血管的拉伸強(qiáng)度[(16.5 ± 2.61)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05]和Zui大持線力[(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]無明顯改變，在100 mm Hg液壓下脫細(xì)胞血管無異常擴(kuò)張;內(nèi)皮種子細(xì)胞在脫細(xì)胞血管支架上生長黏附良好?！窘Y(jié)論】 Triton X-100法對新鮮牛頸靜脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理后果良好，脫細(xì)胞牛頸靜脈可作為細(xì)胞種植的血管支架使用。

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　　【要害詞】 牛頸靜脈;脫細(xì)胞支架;組織工程;細(xì)胞種植

　　Bovine Jugular Vein Decellularized with Triton X-100 as a Potential Scaffold for Vascular Tissue Engineering

　　LU Jun， ZHANG Jing-fang， CHEN Xin-xin， HUANG Wei

　　(Department of Cardiovascular Surgery， Research Center of Medical Sciences， Guangdong Provincial People's Hospital， Guangzhou 510080， China)

　　Abstract： 【Objective】To study the composition and strength of bovine jugular vein decellularized with Triton X-100 and to determine its potential as a vascular tissue-engineering scaffold. 【Methods】 Fresh bovine jugular veins (n = 10) were obtained and divided into two groups (n = 5) at random， the fresh group and the decellularized group， specimens in decellularized group were treated with 2.5 mL/L Triton X-100 and sodium-deoxycholate for 48 h. Residual cells and extracellular matrix composition were studied with light and electron microscopy. The strength of graft was measured in vitro by insufflation and pull-through techniques. Decellularized specimens were seeded with human endothelial cells and cultured for 7 d. 【Results】 2.5 mL/L Triton X-100 together with sodium-deoxycholate completely removed native bovine cells. Collagen morphology and elastin staining appeared unchanged. Compared with fresh bovine jugular vein， decellularized vein had similar in vitro tensile stress [(16.5 ± 2.6)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05] and suture-holding strength [(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]， and had no abnormal dilation under 100 mm Hg intraluminal pressure. Endothelial cells attached to acellular specimens and grew well. 【Conclusion】 Bovine jugular vein rendered acellular with Triton X-100 presented an excellent scaffold for recellularization with human cells.

　　Key words：bovine jugular vein; decellularized scaffold; tissue engineering; seeding

　　帶瓣牛頸靜脈作為移植管道資料近年來逐漸引起國內(nèi)、外學(xué)者器重[1，2]。戊二醛固定處理的牛頸靜脈帶瓣管道已逐漸商品化并開端利用于臨床顯微鏡。但隨著臨床運(yùn)用病例數(shù)的增多和隨訪時(shí)光的延伸，戊二醛固定處理的帶瓣牛頸靜脈的毛病逐漸顯露，例如：宿主的內(nèi)皮細(xì)胞無法遷移生長;輕易涌現(xiàn)血栓、狹小和炎性反映;另外，牛頸靜脈自身固有細(xì)胞殘留還能誘發(fā)宿主移植免疫排擠反響，終極導(dǎo)致管道鈣化和衰敗[4-6]。

　　Zui近的國內(nèi)、外研究發(fā)明脫細(xì)胞的自然血管支架的細(xì)胞外基質(zhì)完整，可增進(jìn)細(xì)胞黏附、生長，而且理化特性與自然血管類似[7-10]，但關(guān)于牛頸靜脈脫細(xì)胞處理的研究鮮見報(bào)道。國內(nèi)呂衛(wèi)東等[11]曾報(bào)道結(jié)合使用5 mL/L Triton X-100 和0.25 g/L 胰蛋白酶等對新鮮牛頸靜脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理72 h，固然管壁細(xì)胞完整往除但血管組織穩(wěn)固性明顯降落。因此聯(lián)合國內(nèi)外研究經(jīng)驗(yàn)，本研究采用2.5 mL/L Triton X-100和2.5 g/L 脫氧膽酸鈉等對新鮮帶瓣牛頸靜脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理48 h，制備血管基質(zhì)支架，并在此基本上進(jìn)行細(xì)胞種植，懂得脫細(xì)胞牛頸靜脈的生物力學(xué)特性和組織相容性變化情形，為進(jìn)一步動物體內(nèi)試驗(yàn)供給理論基本。

　　1 資料和辦法

　　1.1 新鮮帶瓣牛頸靜脈獲取

　　從當(dāng)?shù)夭伺Ｍ涝讖S獲取新鮮帶瓣牛頸靜脈，盡量干凈條件下取出，浸泡在0 ℃～ 4 ℃磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS，Gibco，USA)中運(yùn)回，2 h內(nèi)在無菌條件下剝除血管外膜，挑選管壁完全、內(nèi)附1～ 2組瓣膜、長度8 cm的血管10條，應(yīng)用PBS液重復(fù)沖刷5遍，保留在含有抗生素的4℃ PBS液中(青霉素100 kU/L，鏈霉素0.1 g/L， Gibco， USA)。

　　1.2 血管脫細(xì)胞處置

　　10條牛頸靜脈分兩組，脫細(xì)胞試驗(yàn)組和新鮮對比組，每組5根血管，分辨放進(jìn)50 mL無菌離心管(Corning， USA)中，脫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組：離心管內(nèi)參加含2.5 mL/L Triton X-100(Sigma， USA)、2.5 g/L脫氧膽酸鈉(Amresco， USA)、0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，Gibco， USA)、0.1 g/L核糖核酸酶( ribonuclease， RNase， Sigma) 和0.2 g/L脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuc-lease，DNase，Sigma)的PBS液40 mL，脫細(xì)胞處置48 h，24 h換液1次;新穎對比組：牛頸靜脈僅應(yīng)用PBS液浸泡，24 h換液1次。脫細(xì)胞進(jìn)程在37 ℃恒溫?fù)u床(SCS-24 Shaker， 上海市離心機(jī)械研討所)中連續(xù)振蕩(200 r/min)完成。

　　1.3 病理組織學(xué)檢討

　　脫細(xì)胞進(jìn)程完成后留取兩組血管的部分管壁和瓣膜使用100 mL/L福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin， HE染色)，光學(xué)顯微鏡下視察牛頸靜脈自身細(xì)胞殘留情況。細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原和彈力纖維散布排列情況則使用Verhoff-vonGieson染色(VG染色)結(jié)合Masson染色顯示。

　　1.4 掃描電鏡

　　兩組血管的部分管壁和瓣膜用25 mL/L 戊二醛固定，逐步脫水，置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡(Quanta 400，F(xiàn)EI company， Holland)視察管壁和瓣膜細(xì)胞脫落和纖維排列情況。

　　1.5 生物力學(xué)性能檢測

　　將兩組血管壁縱向裁剪成0.5 cm × 2 cm大小血管條，使用萬能電子拉力機(jī)(Instron5566，USA)測量兩組血管條(n = 10)的縱向拉伸強(qiáng)度(tensile stress)。將4-0 聚丙烯滑線(prolene， Ethicon Inc， USA)縫于同樣大小的血管條邊沿，邊距約2 mm，同樣使用萬能電子拉力機(jī)測量兩組血管條(n = 10) 縱向Zui大持線力(suture-holding strength)。兩組完整血管截取4 cm長行注水試驗(yàn)，近端插管，灌注充斥PBS液，遠(yuǎn)端阻斷鉗封閉，使用冠狀動脈球囊擴(kuò)大測壓裝置(ACS Indeflator，USA)和壓力換能裝置銜接心電監(jiān)護(hù)儀，測量100 mm Hg壓力下兩組血管(n = 5)的直徑變化，同時(shí)視察有無滲漏情況。

　　1.6 血管支架細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)

　　將脫細(xì)胞牛頸靜脈縱向剪開，PBS液重復(fù)沖刷3遍，使用特制的圓形刀具將牛頸靜脈壁裁剪成12個(gè)直徑1 cm的血管圓片，管腔面向上放進(jìn)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，USA)中，每孔參加1 mL 含100 mL/L胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS，四季青公司，杭州)的DMEM/F-12細(xì)胞造就液(Gibco， USA)并放入37 ℃細(xì)胞造就箱中預(yù)襯24 h，然后吸去預(yù)襯液，將自人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞引誘分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞[12]使用DMEM/F-12培育液消化奏樂成密度為7× 108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，在放有血管圓片的12孔中每孔參加0.5 mL細(xì)胞懸液，調(diào)劑終極種植全造就液為1 mL含100 mL/L FCS 、100 kU/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素的DMEM/F-12培育液，放進(jìn)37 ℃、50 mL/L CO2、相對飽和濕度的培育箱中培養(yǎng)7 d，每兩天換液1次。第7天取血管片固定，行慣例HE染色和掃描電鏡檢討，察看種植細(xì)胞在血管片表面的生長情況。

　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方式

　　采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±尺度差表現(xiàn)，采取t檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)剖析，P < 0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 成果

　　2.1 大體肉眼察看

　　脫細(xì)胞后的牛頸靜脈泛白，管壁和瓣膜完整，內(nèi)膜光滑，質(zhì)地與新鮮牛頸靜脈相比無明顯變化。

　　2.2 牛頸靜脈脫細(xì)胞情況

　　病理染色和掃描電鏡顯示，牛頸靜脈管壁全層和瓣膜上自身細(xì)胞基礎(chǔ)完整脫除， 未見明顯細(xì)胞殘留(圖1)，組織構(gòu)造緊湊， 無明顯水腫，顯微鏡報(bào)價(jià)支架報(bào)價(jià)。掃描電鏡可見管腔面和瓣膜表面的內(nèi)皮細(xì)胞脫除后其深層纖維組織袒露(圖2)。

　　2.3 脫細(xì)胞后牛頸靜脈膠原纖維和彈力纖維變更

　　光學(xué)顯微鏡下察看，新鮮牛頸靜脈管壁細(xì)胞外基質(zhì)重要由膠原和彈力纖維構(gòu)成，約占50% ～ 60%以上，瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)重要由膠原纖維組成，約占90%以上，彈力纖維極少。脫細(xì)胞前后管壁的膠原纖維無顯著變化，彈力纖維構(gòu)造完全，瓣膜膠原纖維排列稍疏松，但無明顯斷裂。

　　2.4 生物力學(xué)性能測試成果

　　注水前兩組血管直徑(n = 5)無顯著差別[新鮮組(9.5 ± 0.4)mm vs 脫細(xì)胞組：(9.3 ± 0.4)mm; t = 0.669，P = 0.54];在管腔內(nèi)液壓為100 mm Hg時(shí)，兩組血管膨脹，但均未呈現(xiàn)滲漏情形，脫細(xì)胞血管與新鮮血管相比[新穎組：(20.2 ± 2.1)mm vs 脫細(xì)胞組：(21.7 ± 2.2)mm;t = 1.108，P = 0.33]直徑變化無明顯性差別，并沒有涌現(xiàn)異常擴(kuò)大(表1)。血管壁的拉伸強(qiáng)度[(16.5 ± 2.6)MPa vs(15.5 ± 3.1)MPa; t = 0.558，P = 0.59]和Zui大持線力[(7.9 ± 0.9)N vs(7.0 ± 1.1)N;t = 1.35，P = 0.21]在脫細(xì)胞前后無顯明變化。

　　2.5 血管支架細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)

　　光學(xué)支架(圖3)和掃描電鏡(圖4)顯示內(nèi)皮種子細(xì)胞在脫細(xì)胞血管支架表面生長良好，浮現(xiàn)展路石狀，形成一層持續(xù)生長的單細(xì)胞層，細(xì)胞間呈現(xiàn)纖維銜接。

　　3 討論

　　3.1 脫細(xì)胞方式的選擇

　　有多種方法可以使血管組織脫細(xì)胞，目前常用的脫細(xì)胞方法主要是酶消化法和除垢劑洗滌法。不同的脫細(xì)胞方法在支架細(xì)胞消除率、種子細(xì)胞黏附率及保持血管支架的生物力學(xué)特性等方面存在不同。Triton X-100 是一種非離子型表面活性劑，可以通過其分子上的親水基團(tuán)溶解細(xì)胞而到達(dá)掃除血管壁細(xì)胞成分的目標(biāo)。Samouillan等[13]研究發(fā)現(xiàn)使用Triton X-100 和膽鹽處理瓣膜組織并不影響膠原和彈力纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)固性。Kasimir等[14]研究也發(fā)明不同濃度的Triton X-100(2.5 mL/L和 5 mL/L)都可以完全肅清豬自動脈管壁和瓣膜的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)可以完全保存，但胰蛋白酶脫細(xì)胞法卻可以嚴(yán)重?fù)p壞血管支架的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。呂衛(wèi)東等[11]使用Triton X-100 和胰蛋白酶相聯(lián)合的方法對牛頸靜脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理，也發(fā)明往細(xì)胞處理后牛頸靜脈的組織穩(wěn)固性明顯降落。本試驗(yàn)前期研究曾經(jīng)使用過兩種脫細(xì)胞方法， 一種方法是單獨(dú)使用0.5 g/L胰蛋白酶對新鮮牛頸靜脈脫細(xì)胞處理24 h、48 h和72 h;另一種方法是結(jié)合使用0. 5 g/L胰蛋白酶和2.5 mL/L Triton X-100分辨處理24 h，病理切片和掃描電鏡檢討發(fā)現(xiàn)這兩種脫細(xì)胞方法固然可使管壁和瓣膜表面的內(nèi)皮細(xì)胞完整脫除，膠原纖維改變稍微，但管壁和瓣膜深層仍有大批牛自身細(xì)胞殘留，而且彈力纖維損壞嚴(yán)重，管壁和瓣膜組織疏松。斟酌到胰蛋白酶對組織結(jié)構(gòu)的侵害，再聯(lián)合國內(nèi)外文獻(xiàn)材料[10，15-17]和自身前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究摒棄胰蛋白酶，而采取2.5 mL/L Triton X-100 + 2.5 g/L脫氧膽酸鈉 + 0.2 g/L EDTA + RNase + DNase的脫細(xì)胞辦法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脫細(xì)胞后果滿足而且血管支架的生物力學(xué)特征等無明顯改變。

　　3.2 細(xì)胞外基質(zhì)的保留

　　膠原纖維主要起到保持血管組織自身強(qiáng)度的作用，其中Ⅳ型膠原纖維更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和生長，彈力纖維則負(fù)責(zé)血管的舒張和壓縮，因此這兩種纖維結(jié)構(gòu)完整對于進(jìn)一步的內(nèi)皮種子細(xì)胞種植和組織工程血管的構(gòu)建極其主要。Triton X-100法即能將新鮮牛頸靜脈自身固有細(xì)胞完全肅清又能較好保持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，為內(nèi)皮種子細(xì)胞種植供給了良好的脫細(xì)胞血管基質(zhì)支架。

　　3.3 脫細(xì)胞血管生物力學(xué)特征的變更

　　恰當(dāng)?shù)某跏脊鼙趶?qiáng)度對于構(gòu)建心外移植管道來說非常主要，假如移植管道組織構(gòu)造疏松，不僅不利于手術(shù)縫合，而且會涌現(xiàn)漏血或管道擴(kuò)大，甚至敏捷呈現(xiàn)瘤狀轉(zhuǎn)變。本研討結(jié)果表明經(jīng)過Triton X-100等處置48 h后牛頸靜脈管壁強(qiáng)度并沒有產(chǎn)生顯明轉(zhuǎn)變，這一成果也與膠原纖維和彈力纖維的形態(tài)學(xué)變更相一致。本試驗(yàn)之所以采取100 mm Hg液壓丈量有關(guān)數(shù)據(jù)，是由于脫細(xì)胞牛頸靜脈重要作為重建右心室流出道的移植管道，而右心體系壓力較低，所以100 mm Hg液壓基礎(chǔ)可以反應(yīng)脫細(xì)胞牛頸靜脈是否合適作為組織工程血管支架。由于牛頸靜脈自身瓣膜窄小、微薄，慣例力學(xué)丈量儀器無法對其相干組織強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行丈量，故本試驗(yàn)僅能依據(jù)其膠原和彈力纖維的情形推測其力學(xué)性能無顯著改變，進(jìn)一步關(guān)于管壁和瓣膜的生物力學(xué)性能研討將通過動物在體實(shí)驗(yàn)來完成。

　　3.4 脫細(xì)胞血管的生物相容性

　　內(nèi)皮種子細(xì)胞在脫細(xì)胞牛頸靜脈的管腔面生長黏附良好，表明經(jīng)過Triton X-100等處理的脫細(xì)胞牛頸靜脈生物相容性良好，Triton X-100等無殘留毒性，合適內(nèi)皮種子細(xì)胞種植。

　　綜上所述，本研究以為：2.5 mL/L Triton X-100等對新穎牛頸靜脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理的方式切實(shí)有效;應(yīng)用上述辦法獲得的脫細(xì)胞牛頸靜脈的力學(xué)特征無顯明轉(zhuǎn)變而且能夠進(jìn)行細(xì)胞種植，這為下一步體外動態(tài)細(xì)胞種植和動物體內(nèi)試驗(yàn)供給了理論根據(jù)。

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