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　　 動物細胞培育試驗

　　 細胞培養(yǎng)是用無菌操作的方式將動物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模仿動物體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng)．使其不斷地生長、滋生，人們借以觀察細胞的生長、滋生、細胞分化以及細胞朽邁等進程的性命現(xiàn)象。

　　細胞培養(yǎng)的突出長處，一是便于研討各種物理、化學(xué)等外界因素對細胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細胞培養(yǎng)便于人們對細胞內(nèi)構(gòu)造(如細胞骨架等)、細胞生長及發(fā)育等進程的觀察。因而細胞培養(yǎng)是摸索和唆使細胞性命運動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技巧，同時我們也不可疏忽的另一個因素，那就是它脫離樂生物機體后的—些變更。

　　細胞培養(yǎng)技巧目前已普遍地被利用于生物學(xué)的各個范疇。如分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

　　為此有必要使學(xué)生在細胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識，懂得動物細胞培養(yǎng)的根本操作過程，觀察體外培養(yǎng)細胞的生長特征，對原代細胞與傳代細胞有一個基礎(chǔ)概念。

　　本實驗分兩次進行．即清洗與消毒和傳代細胞的培養(yǎng)與觀察。

　?、袂逑磁c滅菌

　　一、試驗?zāi)繕?

　　能獨立地進行用于細胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，控制干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，懂得化學(xué)消毒法的使用方式。

　　二、實驗原理

　　清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量Zui大，也是Zui基礎(chǔ)的步驟。體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對干凈和無菌的請求水平很高。細胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求清潔透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物資，哪怕殘留0．1個，也可能影響細胞生長。滅菌手腕的選擇十分主要，對不同的物品需采取不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使到達了無菌卻使被滅菌藥品損失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特征或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都先容其使用范疇。

　　三、實驗資料、用品

　　資料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過濾器(直徑25)。

　　藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(產(chǎn)業(yè))，DEPC水[體積分數(shù)0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

　　儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

　　四、實驗步驟

　　(一)清洗

　　1．新玻璃器皿的清洗先用自來水洗擦，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物資和其他有害物資。

　　2．使用過的玻璃器皿的清洗

　　(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸進凈水，避免干枯難洗。

　　(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，顛倒自然干燥。

　　(3)浸酸性洗液過夜。

　　(4)從酸性洗液撈出后自來水沖刷10．15次往除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，顛倒烘干。

　　(5)包裝(牛皮紙或一般紙)。

　　(6)高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。

　　(7)貯存?zhèn)溆谩?

　　3．膠塞的處置

　　(1)新膠塞應(yīng)先用凈水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。

　　(2)自來水清洗10次。

　　(3)再用1％稀鹽酸浸泡30 min。

　　(4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處置可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可應(yīng)用。

　?。ǘ┫?

　　1．物理消毒法

　　(1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料造就皿、培養(yǎng)板等。這是常應(yīng)用的消毒方式之一。

　　(2)干熱滅菌 重要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5－8 h。

　　(3)濕熱滅菌 此辦法也稱為高壓蒸汽滅菌，是Zui有效的一種滅菌辦法。重要利用范疇是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不產(chǎn)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：

　?、偈紫炔榭锤邏哄亙?nèi)的水是否充分，放人物品蓋好蓋。

　?、诩訜岣邏哄?。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以消除鍋內(nèi)的冷空氣。

　　③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥持續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調(diào)節(jié)火力大小堅持該壓力。

　　④結(jié)束加熱，待壓力自然降落至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

　　電熱主動滅菌鍋使用闡明(型號：SANYO Autoclave MLS-3020)：

　　①放氣筒加水至LOW程度線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插進放氣筒里，然后將放氣筒回于原位。

　?、诖蜷_高壓鍋蓋，參加蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。

　?、鄞蜷_電源。

　?、茉O(shè)定高壓溫度及時光，高壓鍋的溫度規(guī)模為105－121℃，高壓滅菌一般采取121℃20—30 min。

　?、莅汛邏旱奈锲分糜诟邏哄亙?nèi)，順時針方向?qū)xhaust鈕旋至close地位。

　?、薹忾]高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛呈現(xiàn)為止。

　?、甙磗tart鈕，開端高壓，在溫度達80℃時顯示器開端顯示溫度，當溫度到達所需的設(shè)定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的唆使燈閃亮，直到高壓時光停止后唆使燈滅，此時蜂叫器報警一聲。當壓力降至0 MPa時，蜂叫器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂叫器報警10次。顯示屏溫度指導(dǎo)消散，此時才可打開鍋蓋。

　　⑧關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

　　(4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以調(diào)換的微孔濾膜，極大地便利了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推進的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌Zui為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

　?、僭谶^濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。

　?、谟貌及茫瑵駸釡缇笫褂?。

　　2．化學(xué)消毒法

　　常用的消毒液有如下幾種：

　　(1)70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。

　　(2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的干凈。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。

　　(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特殊是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上闡明。

　　(4)0．5％過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺逝世。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方法進行。

　　(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。

　　(6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，敏捷放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可到達消毒空氣的目標。

　　3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事項

　　1．清洗玻璃制品時，浸酸之后必定要用自來水沖刷10—15次。由于殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則侵害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube必定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的后果。

　　2．干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免產(chǎn)生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才干開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．

　　3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙濕潤發(fā)霉。

　　4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。

　　5．濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才干使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能決裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時地位要正確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

　　6．應(yīng)用化學(xué)消毒法時，配制75％酒精利用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、剖析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性?？諝庀緯r，所有的物品要事先籌備齊全并使消毒者有較便利的退出道路。由于甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和損害作用。

　　六、思考題

　　1．哪些物品合適于高壓滅菌，并闡明理由。

　　2．紫外線消毒的實用范疇和目的是什么?

　　II、傳代細胞培養(yǎng)與觀察

　　一、實驗?zāi)繕?

　　懂得傳代細胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀態(tài)

　　二、實驗原理

　　傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

　　這種培養(yǎng)，第一步也是制備細胞懸液，當細胞長成致密單層時，它很輕易被蛋白水解酶和EDTA)所損壞。所以—般采取胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混雜物，做為消化液。

　　細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又請求十分嚴謹?shù)膶嶒灱记?。要使細胞能在體外長期生長，必需滿足兩個基礎(chǔ)請求：一是供應(yīng)細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、合適的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴厲把持無菌條件。

　　三、試驗用品

　　1、器材

　　 解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9．9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。

　　此外，還有顯微鏡、血細胞計數(shù)器、血細胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標志筆、解剖板等。

　　2、試劑

　　L磷酸鹽緩沖液(PBs)

　　無鈣、鎂溶液

　　細胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA

　　EMEM液

　　3%谷氨酰胺

　　o．5％臺盤藍染液等

　　3、資料

　　喉癌細胞

　　四、實驗辦法

　　 在做傳代細胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。

　　1.營養(yǎng)液配制:

　　EMEM液 90%

　　犢牛血清 10%

　　雙抗(1萬單位／m1) 加至約100單位／m1

　　3％谷氛酞胺 1m1

　　7．4％NaHCO3 調(diào)pH至6．8—7．0

　　2．換液:

　　在酒精燈旁打開瓶塞，倒往瓶中的細胞養(yǎng)分液。

　　3.消化與分裝

　　在上述瓶中參加1mlEDTA溶液，輕輕動搖，將溶液倒出。反復(fù)上述動作。參加適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層是否涌現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如涌現(xiàn)縫隙，即可倒往消化液；如末呈現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，持續(xù)進行消化，直到涌現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管汲取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，重復(fù)奏樂瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全體脫落下來為止。此時，可持續(xù)輕輕地奏樂細胞懸液，以使細胞散開。隨之進行分裝。

　　4．造就

　　分裝好的細胞瓶上，做好標記，注明細胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細胞均勻散布，以免堆積成團。然后置于37℃培養(yǎng)。

　　5.觀察

　　(1)視察體外培養(yǎng)細胞的幾個問題；

　　細胞培養(yǎng)24h后，即可進行觀察，觀察的重點如下：

　　A.首先要察看培育細胞是否污染。重要視察造就液色彩的變更及混濁度

　　B.察看培育姬色彩變更及細胞是否生長。

　　C.如細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特點并斷定其所處的生長階段，麥克奧迪。觀察時可參照(2)的描寫進行。

　　D．察看完畢，可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以斷定逝世、活細胞的比例。

　　(2)細胞的生長階段及其形態(tài)特點

　　傳代培養(yǎng)的細胞需逐日進行觀察，注意細胞有無污染，培養(yǎng)液色彩的變化及細胞生長的情形?！阒袑优囵B(yǎng)的細胞，從培養(yǎng)開端，經(jīng)過生長、繁殖、朽邁及死亡的全過程。它是一個持續(xù)的生長過程，但為了觀察及描寫，人為地將具分為5個時代，但各期間無顯明盡對界線?，F(xiàn)分辨描寫如下：

　　A．游離期：當細胞經(jīng)消化疏散成單個細胞后，由于細胞原生質(zhì)的壓縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以，此時細胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。

　　B．吸附期(貼壁)：由于細胞的附壁持性，細胞懸液靜置培養(yǎng)一段時光(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細胞，如圓形、扁形、短菱形。細胞的特色，大多立體感強，細胞內(nèi)顆粒少，透明。

　　C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細胞進進滋生期，加速了細胞生長和決裂。此期包含由幾個細胞形成的細胞島(即由少數(shù)細胞緊密湊集而出現(xiàn)的孤立細胞群，常散在地散布在瓶壁上)，到細胞展?jié)M全部瓶壁(即所謂形成細胞單層)的進程。此期細胞形態(tài)為多角形(浮現(xiàn)上皮樣細胞的特點)。細胞特色：透明，顆粒較少，細胞間界線明白，并可模糊見到細胞核。依據(jù)細胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀態(tài)分為四級。以“十”的多少表現(xiàn)如下：

　　十：細胞占瓶壁有效面積(也就是細胞能生長的瓶壁面積)的25％以內(nèi)有新生細胞。一般要視察3—5個視野內(nèi)的細胞生長狀態(tài)，然后加以綜合剖析斷定。

　　十十：細胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細胞。

　　十十十：細胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。

　　十十十十：細胞占瓶壁95％以上，細胞已長滿或接近長滿單層，細胞致密，透明度好。

　　從十十一十十十十為細胞的對數(shù)增加期(或稱為指數(shù)增加期)。 D．保持期：當細胞形成良好單層后，細胞的生長與決裂都減緩，并逐漸結(jié)束生長，這種現(xiàn)象被稱為細胞生長的接觸克制。此時細胞界線逐漸含混，細胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度下降，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積聚，保持液逐漸變酸。此時養(yǎng)分液已變?yōu)槌赛S色或黃色。

　　E．衰退期：由于溶液中養(yǎng)分的減少和日齡的增加，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時細胞間可呈現(xiàn)空隙，細胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細胞經(jīng)固定染色處置后，可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。Zui后，細胞皺縮，逐漸逝世亡，從瓶壁上脫落下來。


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