光學(xué)顯微鏡是為了使肉眼看不明白的標(biāo)本影像,人們假想經(jīng)過一種裝置,使肉眼能夠視察到該標(biāo)本組織形態(tài)和其間的構(gòu)造。這種假想的裝置就被后人發(fā)明問世了。當(dāng)前普遍利用在各種渺小物體的視察、測定、剖析、分類、鑒定等。在波長范疇上也不限於可見光波段(4000~7000 )而且(>2000 )到紅外(1~2u)以及用眼睛察看、顯微、攝影和一般輻射檢測器放大。
顯微鏡的分類是根據(jù)照明辦法,有透射型與反射(落射)型二種。透射型顯微鏡是運(yùn)用透射照明通過透明物體的打光方式。反射型顯微鏡是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。另一種分類方法,系根據(jù)觀察方法的差別,分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、相位差顯微鏡、偏光顯微鏡、干預(yù)相位差顯微鏡、螢光顯微鏡等。每種顯微鏡一般又各有透射型和反射型二種。在這些顯微鏡中,特殊是明視野顯微鏡是構(gòu)成所有顯微鏡中組成Zui基礎(chǔ)的基本。通過這種顯微鏡觀察的物體,穿過透過(吸收)率、反射率,因場合不同而各不雷同,這種物體被稱為隨照明光強(qiáng)度(振幅)變更振幅物體,無色透明物體只有在照明相位轉(zhuǎn)變時(shí),才干被肉眼觀察到,由於明視野顯微鏡不能轉(zhuǎn)變相位,所以對透明不染色標(biāo)本不能被觀察到。
倍率、數(shù)值孔徑與視場數(shù)
顯微鏡的綜合倍率是物鏡倍率G1與目鏡倍率G2的乘積,G=G1×G2。G1是1~100倍,G2是5~20的范疇。
數(shù)值孔徑(Numerical Aperture)N.A.是決議物鏡的辨別率、焦深、圖像亮度的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),如圖所示,當(dāng)物鏡焦點(diǎn)對好后,物鏡前透鏡Zui邊沿處的傾斜光線與顯微鏡光軸所交角成α,此即該物鏡的半孔徑角設(shè)標(biāo)本數(shù)據(jù)空間的折射率為n,則N.A.=n×sinα。
n通常在空氣中為1,在物鏡與標(biāo)本間浸入水、甘油、油脂時(shí),該標(biāo)本折射率,即隨浸液不同而異。這種物鏡稱為浸液系物鏡,學(xué)生顯微鏡;如是空氣時(shí),稱為乾燥系物鏡。圖1左半部分表現(xiàn)浸液系,右半部分表現(xiàn)乾燥系的情形。
在顯微鏡上,限制視野的裝置是視野光圈。以物鏡側(cè)觀看這種視野光圈時(shí)的直徑以mm單位表現(xiàn)的值稱為視野數(shù)。實(shí)際視野=視野。
實(shí)際視野=視野數(shù)/物鏡倍率
例如,視野數(shù)為20,則10×物鏡就觀看2mm視野范疇。利用聚光鏡時(shí),依據(jù)可變的視野光圈,再?zèng)Q議選用聚光鏡的N.A.值,其值是取決於可變聚光鏡孔徑光圈來斷定。
暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡由於不將透明光射進(jìn)直接視察體系,無物體時(shí),視野暗黑,不可能觀察到任何物體,當(dāng)有物體時(shí),以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野觀察物體,照明光大部分被折回,由於物體(標(biāo)本)所在的地位構(gòu)造,厚度不同,光的散射性,折光等都有很大的變更。
相位差顯微鏡
相位差顯微鏡的構(gòu)造:
相位差顯微鏡,是利用相位差法的顯微鏡。因此,比通常的顯微鏡要增添下列附件:
(1) 裝有相位板(相位環(huán)形板)的物鏡,相位差物鏡。
(2) 附有相位環(huán)(環(huán)形縫板)的聚光鏡,相位差聚光鏡。
(3) 單色濾光鏡-(綠)。
各種元件的性能闡明如下:
(1) 相位板使直接光的相位移動(dòng) 90°,并且接收削弱光的強(qiáng)度,在物鏡后焦平面的恰當(dāng)?shù)匚谎b置相位板,相位板必需確保亮度,為使衍射光的影響少一些,相位板做成環(huán)外形。相位板,相位膜及接收膜加工成圖5外形。
(2) 相位環(huán)(環(huán)狀光圈)是依據(jù)每種物鏡的倍率,而有大小不同,可用轉(zhuǎn)盤器調(diào)換。
(3) 單色濾光鏡系用中心波長546nm(毫微米)的綠色濾光鏡。通常是用單色濾光鏡進(jìn)觀察。相位板用特定的波長,移動(dòng)90°看直接光的相位。當(dāng)須要特定波長時(shí),必須選擇恰當(dāng)?shù)臑V光鏡,濾光鏡插進(jìn)后對照度就進(jìn)步。此外,相位環(huán)形縫的中心,必需調(diào)劑到準(zhǔn)確方位后方能操作,對中看遠(yuǎn)鏡就是起這個(gè)作用部件。
應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)
應(yīng)用時(shí),Zui主要的注意事項(xiàng)為下列三點(diǎn):
(1)履行正確的操作辦法。
(2)依據(jù)標(biāo)本的請求,選擇適合的相位差物鏡。
(3)用其他察看方式作比擬,對標(biāo)本作出準(zhǔn)確的斷定。
1.正確操作的Zui主要事項(xiàng)必需正確地調(diào)劑好相位環(huán)的中心。若用圖6中的幾種外形的容器,是不能準(zhǔn)確地調(diào)到中心地位的。因而作為相位差察看用是不適合的。
對相位差像的判定和明視野象的斷定是不雷同的。要注意相差法所持有的特色和不足點(diǎn),相位差物鏡的選擇方式同上。要與其他的觀察法作比擬,以及正確地制造標(biāo)本的辦法,這些都是應(yīng)用時(shí)必要的綜合注意事項(xiàng)。
螢光顯微鏡
在螢光顯微鏡上,必須在標(biāo)本的照明光中,選擇出特定波長的激發(fā)光,以發(fā)生螢光,然后必須在激發(fā)光和螢光混雜的光線中,單把螢光分別出來以供觀察。因此,在選擇特定波長中,濾光鏡體系,成為極其主要的角色。
螢光顯微鏡原理:
(A) 光源:光源幅射出各種波長的光(以紫外至紅外)。
(B) 鼓勵(lì)濾光源:透過能使標(biāo)本發(fā)生螢光的特定波長的光,同時(shí)攔阻對激發(fā)螢光無用的光。
(C) 螢光標(biāo)本:一般用螢光色素染色。
(D) 阻攔濾光鏡:攔阻掉沒有被標(biāo)本接收的激發(fā)光有選擇地透射螢光,在螢光中也有部分波長被選擇透過
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