一、 光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷史
早在公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)明通過球形透明物體往觀察渺小物體時，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認(rèn)識。
1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制作者已經(jīng)造出相似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研討看遠(yuǎn)鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出公道的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時的光學(xué)工匠遂紛紜從事顯微鏡的制作、推廣和改良。
17世紀(jì)中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了出色的貢獻(xiàn)。1665年前后，胡克在顯微鏡中參加粗動和微動調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺。這些部件經(jīng)過精益求精，成為現(xiàn)代顯微鏡的基礎(chǔ)組成部分。
1673～1677年期間，列文胡抑制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保留至今。胡克和列文胡克應(yīng)用自制的顯微鏡，在動、植物機(jī)體微觀構(gòu)造的研討方面取得了出色成績。
19世紀(jì)，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的呈現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇第一個采取了浸液物鏡。19世紀(jì)70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基本。這些都增進(jìn)了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的敏捷發(fā)展，并為19世紀(jì)后半葉包含科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)明細(xì)菌和微生物供給了有力的工具。
在顯微鏡本身構(gòu)造發(fā)展的同時，顯微察看技巧也在不斷創(chuàng)新：1850年涌現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年呈現(xiàn)了干預(yù)顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克發(fā)明了相襯顯微術(shù)，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎。
古典的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合，它以人眼作為吸收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中參加了攝影裝置，以感光膠片作為可以記載和存儲的接受器?，F(xiàn)代又廣泛采取光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接受器，配以微型電子盤算機(jī)后構(gòu)成完全的圖像信息采集和處置體系。
目前全世界Zui重要的顯微鏡廠家重要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內(nèi)廠家主要有：江南、麥克奧迪等。
二、 顯微鏡的基礎(chǔ)光學(xué)原理
?。ㄒ唬?折射和折射率
光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線流傳，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則產(chǎn)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳布速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射進(jìn)透明物體(如玻璃)時，光線在其介面轉(zhuǎn)變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。
?。ǘ?透鏡的性能
透鏡是組成顯微鏡光學(xué)體系的Zui基礎(chǔ)的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。
當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱"焦點"，通過交點并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱"物方焦點"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點，稱"象方焦點"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。
光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上浮現(xiàn)出來，而虛像不能。
（三） 凸透鏡的五種成象規(guī)律
1. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小的倒立實象；
2. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；
3. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象；
4. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象；
5. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的地位形成放大的豎立虛象。
三、 光學(xué)顯微鏡的成象（幾何成象）原理
只有當(dāng)物體對人眼的張角不小于某一值時，肉眼才干差別其各個細(xì)部，該量稱為目視分辨率ε。在Zui佳條件下，即物體的照度為50~70lx及其對照度較大時，可到達(dá)1'。為易于觀測，一般將該量加大到2'，并取此為均勻目鏡分辨率。
物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關(guān)。有公式y(tǒng)=Lε
距離L不能取得很小，由于眼睛的調(diào)節(jié)能力有必定限度，尤其是眼睛在接近調(diào)節(jié)才能的極限規(guī)模工作時，會使視力極度疲勞。對于標(biāo)準(zhǔn)(正視)而言，Zui佳的視距規(guī)定為250mm(明視距離)。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率ε=2'的眼睛，能明白地域分大小為0.15mm的物體細(xì)節(jié)。
在觀測視角小于1'的物體時，必需應(yīng)用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測職員近處應(yīng)予放大的物體的。
（一） 放大鏡的成像原理
表面為曲面的玻璃或其他透明資料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點F以內(nèi)的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。
放大鏡的放大率
Γ=250/f'
式中250--明視距離，單位為mm
f'--放大鏡焦距，單位為mm
該放大率是指在250mm的距離內(nèi)用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。
?。ǘ?顯微鏡的成像原理
顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的渺小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。
圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為便利計，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表現(xiàn)。物體AB位于物鏡前方，分開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必定形成一個倒立的放大的實像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點F2上，或者在很靠近F2的地位上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛察看。虛像A''B''的地位取決于F2和A'B'之間的距離，可以在無窮遠(yuǎn)處（當(dāng)A'B'位于F2上時），也可以在視察者的明視距離處（當(dāng)A'B'在圖中焦點F2之右邊時）。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。
?。ㄈ?顯微鏡的主要光學(xué)技巧參數(shù)
在鏡檢時，人們總是盼望能清楚而明亮的幻想圖象，這就須要顯微鏡的各項光學(xué)技術(shù)參數(shù)到達(dá)必定的尺度，并且請求在應(yīng)用時，必需依據(jù)鏡檢的目標(biāo)和實際情形來和諧各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才干充足施展顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿足的鏡檢后果。
顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包含：數(shù)值孔徑、分辯率、放大率、焦深、視場寬度、籠罩差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互接洽又相互制約的，在應(yīng)用時，應(yīng)依據(jù)鏡檢的目標(biāo)和實際情形來和諧參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。
1． 數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的重要技巧參數(shù)，是斷定兩者（尤其對物鏡而言）性能高下的主要標(biāo)記。其數(shù)值的大小，分辨標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。
數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表現(xiàn)如下：NA=nsinu/2
孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱螅M(jìn)進(jìn)物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。
顯微鏡視察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的措施是增大介質(zhì)的折射率n值。基于這一原理，就發(fā)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于1。
數(shù)值孔徑Zui大值為1.4，這個數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4?。
這里必需指出，為了充足施展物鏡數(shù)值孔徑的作用，在視察時，聚光鏡的NA值應(yīng)即是或略大于物鏡的NA值。
數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著親密的關(guān)系，它幾乎決議和影響著其他各項技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應(yīng)地變小。OLYMPUS現(xiàn)在推出了世界Zui先進(jìn)的物鏡設(shè)計理念與Zui先進(jìn)的精密加工技術(shù),使50倍物鏡的數(shù)值孔徑在0.8的情況下工作距離到達(dá)1毫米,100倍物鏡的數(shù)值孔徑在0.9的情形下工作距離達(dá)到1毫米,這幾乎是一個接近于理論的數(shù)值.
2． 分辨率
顯微鏡的辨別率是指能被顯微鏡清楚區(qū)分的兩個物點的Zui小間距，又稱"辨別率"。其盤算公式是σ=λ/NA
式中σ為Zui小分辯間隔；λ為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的辨別率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決議。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，辨別率就越高。
要進(jìn)步分辯率，即減小σ值，可采用以下辦法
?。?） 下降波長λ值，使用短波長光源。
?。?） 增大介質(zhì)n值以進(jìn)步NA值（NA=nsinu/2）。
?。?） 增大孔徑角u值以進(jìn)步NA值。
?。?） 增添明暗反差。
3． 放大率和有效放大率
由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)當(dāng)是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：
Γ=βΓ1
顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過更換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠便利地轉(zhuǎn)變顯微鏡的放大率。
放大率也是顯微鏡的主要參數(shù)，但也不能盲目信任放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。
分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有接洽的概念。有關(guān)系式：500NA<Γ<1000NA
當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)構(gòu)造，此時即使過度地增大放大倍率，學(xué)生顯微鏡，得到的也只能是一個輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之假如分辨率已滿足請求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的才能，但因圖像太小而仍然不能被人眼清楚視見。所認(rèn)為了充足施展顯微鏡的分辨才能，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率公道匹配。
4． 焦深
焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當(dāng)焦點對準(zhǔn)某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看明白，而且在此平面的高低必定厚度內(nèi)，也能看得清晰，這個明白部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：
?。?） 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。
?。?） 焦深大，分辨率下降。
由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成艱苦。在顯微照相時將具體先容。
5． 視場直徑（Field Of View）
觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范疇叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決議的。
視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范疇。視場直徑愈大，愈便于察看。
有公式 F=FN/β
式中F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN，標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)），β:物鏡放大率。
由公式可看出：
?。?） 視場直徑與視場數(shù)成正比。
?。?） 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。目前顯微鏡Zui大視場數(shù)是OLYMPUS的26.5
6． 籠罩差
顯微鏡的光學(xué)體系也包含蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不尺度，光線從蓋玻片進(jìn)進(jìn)空氣發(fā)生折射后的光路產(chǎn)生了轉(zhuǎn)變，從而發(fā)生了相差，這就是籠罩差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。
國際上規(guī)定，蓋玻片的尺度厚度為0.17mm，允許范疇在0.16-0.18mm，在物鏡的制作上已將此厚度規(guī)模的相差盤算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所請求的蓋玻片的厚度。
7． 工作距離WD
工作間隔也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習(xí)慣所說的調(diào)焦，實際上是調(diào)節(jié)工作間隔。
在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。
數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。
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